RDA技术分析病毒性肝硬化、原发性肝细胞癌相关基因的研究

发布时间：2020-07-31 10:22

【摘要】：乙型和丙型肝炎病毒(Hepatitis B／C Virus，HBV／HCV)是引起肝硬化、原发性肝细胞癌等疾病的主要因素。在我国仅HBV慢性感染者就有1.25亿，HCV感染者也高达3800万。每年有大量的肝硬化病人死于包括原发性肝细胞癌在内的多种并发症。病毒感染者通常会经历病毒性肝炎——肝硬化——肝癌的典型病程，然而这一病程的确切机制并不清楚。病毒感染人体后与宿主细胞发生复杂的相互作用，其中涉及宿主细胞的多种基因、多种信号途径。分析感染后病变肝脏细胞基因的表达变化，不仅可以从一定程度上理解病毒致病的分子生物学，而且也为揭示病毒性肝硬化、原发性肝细胞癌的发病机理提供依据。同时这些差异表达的基因则可能成为新的肝病诊断标志或治疗靶点。 本研究选取正常肝脏组织和肝硬化组织(乙型肝炎病毒表面抗原阳性)、原发性肝细胞癌及癌旁组织(丙型肝炎病毒抗体阳性、核酸阳性)为研究对象，综合多个研究者对代表性差异分析(representational difference analysis，RDA)技术的改进方案分别进行了两组研究标本正向和反向的消减杂交，两轮杂交后的产物被克隆到pGEM-T载体中。挑取部分阳性克隆制备杂交膜，分别以同位素标记来源于各研究标本的扩增子以及第二轮杂交产物为探针，进行高通量的斑点杂交，获得多个差异表达的基因：(1)在肝硬化组织中上调的基因包括谷氨酸转氨酶(glutaminase 1)、醛糖还原酶(aldo-keto reductase family 1 B10，AKR1B10)、钙结合的酪氨酸磷酸化调节蛋白(calcium-binding tyrosine 博士学位论文摘要 phosphorylation一regulated protein，CABYR)、雌激素应答B盒蛋白(Estrogen responsive B box protein，EBBP)等基因以及两个对应于新基因的EST(expressed sequenee tag)片段等。下调表达的基因包括CD27结合蛋白(CD27 binding proteinSivas鸇27BP)和烟酞胺甲基转移酶(nieotinamide N一methyltransferase，NNMT)等。(2)在肝癌组织中上调表达的基因有微管蛋白 (gamma一tubulin)，丝氨酸脱氢酶(serine dehydratase，SDS)，P450色素家 族蛋白(eytoehrome P450，fami ly 11，subfamilyB，PolypeptideZ，CYPXIBZ)。 下调表达的基因包括与外毒素酶解代谢以及血浆蛋白的合成的相关基因以及肿瘤 相关基因丝氨酸蛋白酶11(protease，serine 11，HTRA serine protease，pRSSll)、 原肌球蛋白一1(Tropomyosin一l，TM一l)以及两个对应于新基因的EST片段等。选择 部分基因进一步用半定量RT一PCR的方法鉴定其在相应类型标本中的表达。CABYR 基因在正常肝脏中不表达，而在所有的13份肝硬化组织中都激活表达，同时钙结 合的酪氨酸磷酸化调节蛋白基因在7/9的肝癌组织中上调表达，表明该基因于转 录水平上在肝病发生中发挥重要作用。目前尚未有这一基因参与包括肝病在内的 人类疾病的相关研究。PRSS 11、TM一1基因在9份肝癌组织中呈现了不同的表达模 式。 通过本研究，可以得出如下结论:(1)利用RDA技术分离获得多个参与病毒 性肝硬化、肝癌发生的基因，其中包括一些新基因，EBBP、CABYR以及PRSSll基 因参与肝病的发生为我们首次报道。CABYR基因及其表达产物在肝癌发生中的作用 有待进一步研究。(2)结合RDA和高通量的再筛选可以有效分析细胞在病理状态下 差异表达的基因，是了解宿主和病毒相互作用的有效方法。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R575.2;R735.7
【图文】：

用于杂交的两种扩增子范围一致，适合于进一步的分析。在实验中通过缩小杂交体系的规模，即将每轮所用驱动扩增子的量从40pg减少到5pg，大大减少了所需起始样本的量。图1一1显示了来源于100“g总RNA在稀释PcR法川以及1:100、1:800二轮杂交后，可以有效地富集大量的差异基因。参照文献〔2，，为保留差异基因的多样性，我们没有进行更高比率的杂交。同时，正反向杂交产物显示了不同产物模式，表明杂交的过程中没有DNA污染。bP2000一n﨑一UO

本文编号：2776344