Grp75通过改善线粒体功能对氧化损伤条件下肝脏的保护作用

发布时间：2020-08-01 17:23

【摘要】：肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应,表现为肝内结缔组织增生与沉积。现代研究表明,现在常见多发的急,慢性肝病例如病毒型肝炎,脂肪肝,酒精肝等大部分病例在早期都表现为肝纤维化,如果不能及时发现并有效抑制,就会进一步发展成为肝硬化乃至肝癌,直接危及患者生命。所以阻止或者延缓肝纤维化的发生,就可以治愈大多数慢性肝病[1]。而正常肝细胞损伤现在被视为激活肝纤维化的最初信号,并且随着肝细胞的持续受损,肝纤维化将不断加剧。因此寻找合适的治疗靶点阻止肝损伤,治疗肝损伤对临床肝病的治疗有非常重要的意义。[2] 肝细胞的氧化损伤的发生是肝纤维化的早期的病理过程,肝纤维化是肝脏内纤维结缔组织增生导致的慢性疾病,在肝纤维化的病理过程中,肝星形细胞的激活,是其显著的特征,而肝细胞的氧化损伤和凋亡往往是肝纤维化发生的始动因素。葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein75, Grp75)是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣,在缺糖、辐射等应激条件下,Grp75呈上调表达,以起到保护蛋白质,协助蛋白质(特别是线粒体蛋白质)转运,提高细胞对应激反应耐受性的作用[3]。Grp75在缺糖损伤时Grp75通过减少ROS (reactive oxygen species)和脂质过氧化物的产生,以及增加ATP (adenosine triphosphate)水平保护细胞[4]。 Grp75在心脏、脑、肺、脾等多种组织中有构成性表达,当细胞损伤发生时,伴侣分子Grp75可以应激性上调,起到细胞保护效应,抑制细胞凋亡进程[5]。然而Grp75在肝组织中却没有构成性表达,因此为探究Grp75在肝细胞发生损伤时,对细胞和整体动物的保护作用,我们首先构建Grp75/EGFP-N2质粒并用Lipofectamine2000将质粒转染入HL-7702细胞,通过G418筛选得到稳定Grp75过表达细胞株,随后加入400umH2O2制造肝细胞氧化损伤模型,通过对MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide]的检测鉴定细胞活力[6],结果显示在H202刺激下Grp75过表达组细胞的细胞活力要比HL-7702细胞要高。通过比色法检测细胞培养基上清中AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase)这提示我们Grp75可以保护在H202刺激下的肝细胞。为探究其作用机制我们分别检测了细胞中ATP, ROS,线粒体膜电位,和Cytochrome C等线粒体功能相关指标。ATP检测显示,在H202诱导下Grp75过表达组细胞的ATP生成量要明显高于HL-7702细胞。ROS水平检测显示,在H202诱导下Grp75过表达组细胞中ROS的产生要明显小于对照组HL-7702细胞,提示在H202诱导下Grp75可以抑制细胞中ROS的生成。通过JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)标记线粒体膜电位,从而观察线粒体膜电位变化,结果显示在H2O2诱导下Grp75的膜电位崩解趋势要比对照组HL-7702细胞株要低,提示Grp75可以保护细胞中线粒体膜电位。通过Western blo险测细胞胞浆中Cytochrome C的水平,结果显示在H202刺激条件下,Crp75过表达组细胞胞浆中Cytochrome C水平明显比较对照HL-7702细胞株要低,说明Crp75可以抑制线粒体中Cytochrome C的释放。以上结果说明Grp75可以通过促进ATP的生成,抑制ROS生成,保护线粒体膜电位和抑制细胞中Cytochrome C的释放从而达到保护肝细胞的目的。为了在整体水平验证以上结果,我们将100-150g雌性Wistar大鼠随机分为四组,其中两组用jetPEI-in vivo通过尾静脉注射将Grp75定向转染入大鼠肝脏中以构造Grp75肝脏过表达大鼠,CCL4(carbon tetrachloride)诱导肝纤维化,免疫组化检测组织中Grp75表达量,组织学HE染色鉴定肝脏损伤,血清AST,ALT检测肝损伤；ATP, Cytochrome C检测肝组织线粒体功能。免疫组化结果显示,在正常组大鼠中Grp75几乎没有表达,在CCL4组中有Grp75表达,其表达量与Grp75过表达组中基本相似,在CCL4诱导下Grp75过表达组中Grp75表达最高。组织学HE染色结果表明在CCL4诱导下,与对照组大鼠相比,Grp75过表达组大鼠的肝脏中,汇管区聚集减轻,组织中空泡状结构减轻,纤维组织增生较少,纤维间隔减少,表明Grp75可以抑制CCL4所诱导的肝损伤。检测肝脏组织中ATP和Cytochrome C我们得到与细胞实验相似的结果,这说明在整体水平Grp75可以通过促进ATP的生成,抑制细胞中的Cytochrome C的释放从而达到保护肝脏的目的。综上所述,我们发现Grp75可以通过改善线粒体功能从而对肝细胞氧化损伤起到保护作用。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.2

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