肝干细胞和肝癌细胞β-catenin蛋白表达及诱导分化的实验研究

发布时间：2020-08-01 18:13

【摘要】： 肝部分切除后肝叶增大直至恢复原肝的质量、慢性乙型病毒性肝炎后期的结节性肝硬化和肝癌切除术后癌的复发(可能是转移灶)等现象均表明肝脏具有很强的再生能力,生长因子和细胞因子启动和调控肝脏再生。参与肝再生的成体肝干细胞(adulthepatic stem cells,DHSC)是肝细胞发育、增殖、分化和癌变等生理、病理过程中的关键角色。最近的研究发现wnt信号途径关键蛋白β-catenin直接参与靶基因的转录和细胞间的粘附,不仅是细胞增殖和分化的强力调节因子,而且促进干细胞(stem cell)的维持和自我更新、干细胞特化和影响细胞系命运决定。wnt信号途径在干细胞发育,包括增殖、分化、调节等过程,和在肝及结肠癌发生、发展和转移过程中也发挥非常重要的作用。肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)具有分化成肝细胞和胆管上皮细胞的双向分化潜力。肝干细胞可能有三种去向:(1)通过自我更新,生成新的干细胞;(2)分化或演变为肝细胞、胆管细胞;(3)肝干细胞和肝癌细胞具有相同的肝脏微环境,在肝癌的模型和临床病理中发现癌组织和癌旁组织含有肝干细胞。研究提示,分化程序错误可能诱发肝癌,也就是说肝癌细胞来源于肝干细胞。新近研究发现wnt信号途径不仅调控干细胞增殖、分化,也调控癌干细胞(cancer stem cells,CSC)的增殖与分化。尽管wnt信号和肝干细胞如此重要的作用,但是肝干细胞是否存在wnt信号途径的作用很少有人进行研究,肝癌细胞浆和胞核β-catenin表达及分布目前的免疫组化检测方法也不准确,很少有人对比性研究肝干细胞和肝癌细胞β-catenin表达和诱导分化方面的差异。因此,我们研究了肝干细胞和肝癌细胞β-catenin表达,细胞内分布和诱导分化条件下两种细胞形态、生长曲线、细胞分泌白蛋白和AFP功能及β-catenin分布的差异,探讨wnt信号在肝干细胞分化与增殖,肝癌细胞增殖作用的差异性。 目的: 1.摸索较为经济实用的肝干细胞的分离培养及鉴定分析方法。通过建立大鼠肝卵圆细胞的增殖模型,采用胶原酶消化法分离卵圆细胞,再经过Percoll密度梯度离心纯化,分离出肝卵圆细胞。进行培养和肝干细胞标志物鉴定,期望得到下步试验所需要的肝干细胞,进一步研究肝干细胞定向诱导向肝细胞和胆管细胞分化的细胞形态学变化规律。 2.通过对wnt信号途径的关键分子β-catenin在肝干细胞和肝癌细胞的表达及细胞内分布的比较,研究wnt信号在肝干细胞和肝癌细胞分布的差异及其对细胞增殖、分化作用的关系。证实wnt信号途径对肝卵圆细胞增殖及分化的调控作用。 3.通过肝干细胞和肝癌细胞在诱导分化前后细胞形态、生长曲线、细胞分泌白蛋白和AFP功能变化,及β-catenin分布的差异比较,研究β-catenin在肝干细胞和肝癌细胞增殖和分化中发挥的作用。 方法: 用AAF/PH建立了大鼠肝卵圆细胞增殖模型,用胶原酶消化法自大鼠AAF/PH模型中分离单个肝卵圆细胞,经过Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞悬液,细胞悬液接种于0.2%明胶处理的含10%胎牛血清和含SCF 20ng/ml,HGF 10ng/ml,EGF 10ng/ml,LIF 10n妙ml的DMEM/F12培养液的培养瓶进行增殖培养。新分离的肝卵圆细胞用免疫荧光和Western Blotting检测c-kit干细胞抗原,RT-PCR法检测其CK19和白蛋白抗原,对肝卵圆细胞进行鉴定。采用免疫细胞化学,免疫组织化学和Western Blotting技术检测β-catenin在肝干细胞和肝癌细胞的表达及其细胞膜、细胞浆和细胞核分布,比较肝干细胞和肝癌细胞表达和细胞内分布的差异性。用含生长因子SCF 20ng/ml,HGF10ng/ml,EGF 10n妙ml,地塞米松1.0×10~(-7)mol/L,1.5%DMSO,HSS 20n妙ml的诱导培养液对进行肝干细胞及肝癌细胞株的诱导分化,观察诱导分化前后两种细胞形态变化和β-catenin表达和细胞表达及分布的变化。 结果: 1.成功制造了大鼠AAF/PH肝卵圆细胞增殖模型,部分肝切除手术后11～12d取肝,经过胶原酶IV消化肝组织和Percoll梯度离心肝细胞悬液等相对简单的方法提纯肝卵圆细胞,所得细胞存活率90%,细胞数1.0×10~5～1.0×10~6/ml。新分离的肝卵圆细胞大小基本均匀,为卵圆形,其直径相当于成熟肝细胞1/4-1/6。免疫荧光技术和免疫印迹分析显示新分离的肝卵圆细胞有c-kit抗原表达,而成熟的肝细胞和胆管细胞就无明显的c-kit蛋白表达。RT-PCR分析显示,成熟的肝细胞仅表达白蛋白mRNA,胆管上皮细胞仅表达CK19的mRNA,而新分离的肝卵圆细胞表达CK19和白蛋白基因mRNA,提示肝干细胞具有干细胞标志和成熟的肝细胞及胆管上皮细胞的标志,具有两种分化的潜能。我们采用的AAF喂养大鼠方法、肝组织取材和消化、梯度离心和肝卵圆细胞培养方法与前人都有有明显的改进。 2.免疫细胞化学染色显示WB大鼠肝干细胞、L_2肝细胞、SMCC-7721和HepG2人肝癌细胞胞膜和胞浆均有β-catenin表达,而传统的免疫组化对细胞核内表达不易分辨清楚。我们首次采用Western Blotting检测四种细胞株和新分离的肝卵圆胞浆和胞核β-catenin,发现五种细胞胞浆均有明显β-catenin表达,HepG2和SMCC-7721肝癌细胞株灰色条带较深,而肝细胞和肝干细胞灰色条细而浅,肝卵圆细胞浆只有少量β-catenin表达。HepG2和SMCC-7721细胞胞核β-catenin表达明显,核内条带灰度甚至比细胞浆高,而WB和L2肝细胞仅有少量表达,肝卵圆细胞核内未检测到β-catenin积聚,提示肝癌细胞浆和细胞核有β-catenin较高表达。 20例肝癌组织β-catenin免疫组化染色显示细胞膜、细胞浆均有不同程度表达,与正常组织和肝硬化的组织相比,有三个显著特点:①肝癌细胞膜β-catenin表达量明显减少,胞膜分布不连续,甚至缺如,细胞间界限不清楚:②细胞浆Qg明显的β-catenin过表达,且细胞浆分布不均匀。③随肝癌分化程度不同,β-catenin表达也有明显差异,高分化肝癌细胞膜β-catenin分布较为清楚连续,细胞间有界限,细胞浆表达量较多,分布均匀。中度分化的肝癌细胞膜和细胞浆内β-catenin分布界与高低分化之间。低分化肝癌,β-catenin在细胞膜表达较少,细胞界限不清楚,细胞浆β-catenin分布不均匀,呈点状积聚。 Western Blotting检测肝癌细胞核β-catenin表达情况,结果显示,正常组织细胞浆有β-catenin表达,而细胞核未见明显的β-catenin表达,灰色条带不明显,而且6例肝癌组织(其中1例为低分化肝癌)细胞浆和细胞核β-catenin表达均较为明显,核内β-catenin条带灰度甚至比细胞浆高,结果提示肝癌细胞浆β-catenin过表达和胞核β-catenin积聚。 3.从HepG2、SMCC-7721和WB细胞株诱导前后细胞生长曲线的变化看,相同时间内诱导剂使细胞增殖提高1倍,而且在前五天生长较快。WB肝干细胞株在诱导后第3d、5d、7d产生白蛋白较HepG2细胞高(P0.01、P0.05、P0.05),第5d产生白蛋白较SMCC-7721细胞高(P0.05),然而,这三种细胞在诱导期细胞株产生AFP的差异无统计学意义(P0.05)。诱导后HepG2、SMCC-7721和WB细胞形态呈现不同程度的变化,细胞变为多形性或长梭状,但始终未见象肝卵圆细胞那样分化产生成熟的肝细胞。免疫细胞化学显示诱导前后三种细胞株β-catenin的表达及胞膜、胞浆分布无明显变化。新分离的肝卵圆细胞诱导分化第3d出现成熟的肝细胞,第5d出现类似胆管样的长梭形细胞。随着时间延长,肝干细胞数目逐渐减少,成熟的肝细胞增多,后期树突样胆管细胞为主。新分离的肝卵圆细胞加氯化锂后,第3d肝卵圆细胞增殖加快,分化为成熟肝细胞数目较未加氯化锂者少。Western Blotting检测三种细胞株胞浆和胞核β-catenin表达条带灰度与诱导前相近,肝卵圆细胞浆有少量表达,胞核未见明显β-catenin表达条带。提示诱导分化剂对于三种细胞株,不象肝卵圆细胞那样分化明显,只是细胞形态和增殖速度的变化。两种检测结果提示对于增殖较快的细胞株和肝癌细胞,β-catenin在胞浆和胞核有较高的表达和分布,而较易分化的肝卵圆细胞胞浆表达β-catenin量少,胞核无明显β-catenin积聚。 结论: 1.本研究成功制造了大鼠AAF/PH肝干细胞增殖模型,建立了利用简单实用分离肝干细胞的方法。不仅注意到肝干细胞直径只有成熟肝细胞的1/4～1/6,其具有干细胞的标志,具有成熟肝细胞和胆管细胞的标志,即有向两个方向分化的潜能,而且经过诱导培养更清楚的观察到肝卵圆细胞分化成肝细胞和胆管细胞的细胞体积和形态的变化过程。 2.本实验使用western blotting方法检测细胞浆和胞核β-catenin表达,比免疫组化更精确和直观,结合免疫组化对细胞膜和胞浆β-catenin表达,更准确检测细胞膜、细胞浆和细胞核分布。肝干细胞和肝癌细胞在β-catenin表达和细胞内分布具有明显差异,肝干细胞胞膜分布均匀连续,胞浆有少量表达,胞核内没有积聚。而癌细胞胞膜β-catenin分布不均匀、不连续甚至缺如,细胞分化越差胞膜β-catenin分布越少,肝癌细胞浆存在β-catenin过度表达,胞核内β-catenin积聚非常明显。这种细胞β-catenin分布的差异决定其生物学行为的不同,肝癌胞膜β-catenin分布越少可能与癌细胞易肝内血行转移有关,胞核内β-catenin积聚使癌细胞增殖快,分化不良等癌高度恶性可能有联系。研究结果提示β-catenin在肝干细胞和肝癌细胞表达和细胞内分布与其增殖速度和分化程度有很大关系。 3.肝卵圆细胞经诱导产生成熟肝细胞和胆管上皮样细胞,分化过程中干细胞具有体积由小到大,细胞形态也有较大改变的过程。对此过程的认识,有利于肝癌可能起源于肝干细胞理解,这与过去认为肝癌起源于体积大而成熟的肝细胞有很大差异。肝卵圆细胞存在β-catenin表达,氯化锂可使肝卵圆细胞增值加快,分化却受到抑制,证实了肝干细胞同样存在β-catenin信号途径,而且也可能调控肝干细胞的增殖和分化。 4.从某些方面看,肝干细胞和肝癌细胞β-catenin蛋白表达有差异,也有共性。肝干细胞株具有永生性生长的能力,诱导分化培养液中多种细胞生长因子通过其相应受体激活胞浆β-catenin信号,促进细胞的增殖。肝干细胞株增殖速度较快,具有癌细胞的胞浆和胞核β-catenin积聚的特征,所不同的是细胞膜分布均匀连续,又具有良性细胞的特性。原代的肝卵圆细胞和肝干细胞株在β-catenin表达及细胞膜和胞浆分布相似,肝癌组织和肝癌细胞株β-catenin胞膜、胞浆和胞核相似,这两种类型细胞增殖和分化状态都与β-catenin表达和细胞内亚分布有关系。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R735.7;R575
【图文】：

提示肝癌细胞浆和细胞核均有p一。atenin较高表达。 HePGZSMCCWBLZHOC图2一10五种细胞胞浆p一catenin蛋白表达HepGZ:HepGZ人肝癌细胞株;SMee:SMee一7721WB:WB鼠肝干细胞株;LZ:鼠肝细胞株;HOC:人肝癌细胞株鼠肝卵圆细胞HePGZ SMCCWB LZHOC图2一11四种细胞胞核p一catenin蛋白表达HepGZ:HepGZ人肝癌细胞株;SMCC:SMCC一7721人肝癌细胞株WB:WB鼠肝干细胞株;LZ:鼠肝细胞株;HOC:鼠肝卵圆细胞三、免疫组化检测卜catenin在不同肝组织的表达正常肝组织排列较为整齐，肝板结构清楚，肝小叶可见，肝细胞大小一致，细胞很少有空泡结构，细胞之间分界清楚。p一catenin在细胞膜显示清晰、完整，分布均匀，细胞界限清楚，细胞浆内有少量的p一catenin分布(图2一12)。细胞核用苏木素衬染后呈浅紫色，难以分辨核p一catenin分布情况。肝硬化组织的肝板结构仍然清楚，细胞排列紊乱，细胞大小不一致，细胞内有空泡变性，但细胞之间界限清楚，与正常肝组织有相似之处。p一catenin在细胞膜显示清晰、完整

胞浆成分减少。细胞核内p一catenin分布用一般的免疫组化法不易分辨清楚;③随肝癌分化程度不同，p一。atenin表达也有明显差异，高分化肝癌细胞膜p一catenin分布较为清楚连续，细胞间有界限，细胞浆表达量较多，分布均匀(图2一巧)。中度分化的肝癌细胞膜和细胞浆内p一。atenin分布界与高低分化之间(图2一16，2一17)。低分化肝癌，p一catenin在细胞膜表达较少细胞界限不清楚，细胞浆p一catenin分布不均匀，呈点状积聚(图2一18，2一19)。四、W七sternB一otting检测肝组织内细胞质和细胞核p·catenin表达鉴于免疫组化检测细胞核内p一catenin有困难，我们首次采用 WesternBlotting法检测肝癌细胞核p一catenin表达情况。结果显示，正常组织细胞浆有p一。atenin表达

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本文编号：2777818