肠出血性大肠杆菌O157:H7质粒pO157_Sal的功能探索

发布时间：2020-08-07 05:02

【摘要】：肠出血性大肠杆菌O157:H7(Enterohemorrhagic Escherchia coli O157:H7, EHEC O157:H7)是一种重要食源性病原菌,可引起出血性肠炎(hemorrhagic colitis, HC)和溶血性尿毒综合征(hemolytic-uremic syndrome, HUS)。1982年在美国首次发现,我国1986年在江苏徐州市首次分离到O157：H7。1999在苏皖地区发生了暴发流行。EHECO157：H7的主要毒力基因包括噬菌体编码的志贺毒素、LEE (Locus of enterocyte effacement, LEE)毒力岛编码的紧密黏附素EAE (intimin),质粒编码的溶血素等。我们实验室的研究发现1999年苏皖疫情菌株均携带1个新的38kb的质粒pO157_Sal,1999年以后我国分离的菌株均没有这个质粒。功能不明。 本研究应用一步缺失法在质粒pO157_Sal的CDCO157p2_0036(第36个基因)和nikB基因之间插入了卡那霉素抗性标记基因,并通过接合试验证明了pO157_Sal具有接合转移功能。使用SDS-变温方法成功消除了EHECO157:H7Xuzhou21菌株的质粒pO157_Sa1,构建了质粒缺失株Xuzhou21m。将标记卡那霉素抗性的pO157_Sal转化入Xuzhou21m,构建了质粒回补株Xuzhou21c,比较了三株菌在某些表型方面的差异,包括质粒拷贝数、酸抗性、stx2转录、细胞毒、刺激细胞产生血清细胞因子、鞭毛蛋白FliC的表达、动力以及碳源代谢谱等方面。 我们提取两株菌的总RINA进行测序,基因的表达量用RPKM方法进行计算,发现pO157_Sal上的52个基因都全部转录,一共发现168个差异表达基因,其中163个位于染色体和5个位于p0157质粒。与Xuzhou21m相比,Xuzhou21的上调基因有67个,下调基因有101个。GO注释和KEGG分类发现,这些差异表达基因与应激反应、适应不良环境以及毒力相关基因表达有关。7个差异表达基因与脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate, NaDC)抗性相关,包括多药输出系统亚单位基因(multidrug efflux system subunit gene, mdtA)、腺嘌呤特异的DNA甲基转移酶基因(adenine-specific DNA-methyltransferase gene,dam)、高渗透压诱导的周质蛋白基因(hyperosmotically inducible periplasmic protein gene, osm Y)和4个氧化还原相关基因(oxidation-reduction related genes)。osmY和跨内膜噬菌体休克蛋白基因(peripheral inner membrane phage-shock protein, pspD)与抵抗高渗透压有关。有些DEGs是毒力相关的,包括4个编码Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system, T3S S)效应蛋白的染色体基因和位于p0157上的肠溶血素D (enterohemolysin, ehxD)基因。DEGs结果表明质粒pO157_Sal可影响染色体和p0157上的基因表达,质粒消除株Xuzhou21m在高渗透压或者含NaDC的M9培养基中比Xuzhou21生长速度慢；质粒回补株Xuzhou21c恢复了对高渗透压和胆盐的耐受。 研究发现位于pO157_Sal质粒上的stpA和hha可调控其他基因的表达。我们以质粒pBAD30为载体,构建了stpA和hha的回补株,发现hha有提高渗透压和胆盐耐受的作用,还抑制了某些毒力基因的表达,如T3SS效应蛋白espF和espH等。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R574
【图文】：

中国疾病预防控制中心博士学位论文 3.结果3.1质粒婉以Xuzhou21为出发菌株，应用一步缺失的方法在p0157—Sal的非编码区插入卡那霉素抗性基因。蹄选到了一株具有卡那霉素抗性的Xuzhou21,经PCR和测序证明在CDC0157p2—0036 (第36个基因）和威基因之间插入了卡那霉素抗性基因，命名为Xuzhou21k。PCR鉴定结果见图2。

Xuzhou21和Xuzhou21mPCR鉴定

图 4. Xuzhou21 和 Xuzhou21m 的 PFGE 鉴定H9812, 1和2分别为Xuzhou21和Xuzhou21m用Xbal酶切后的PFGE图谱；3和4为Xuzhou21和Xuzhou21m未酶切的电泳条带。

本文编号：2783523