HIFs及NF-κB在布加综合征致肝脏损伤中的作用机制研究

发布时间：2020-08-09 04:41

【摘要】：背景布加综合征(Budd-Chiari syndrome,BCS)是肝静脉和(或)其开口以上的下腔静脉阻塞导致的门静脉和(或)下腔静脉高压临床症候群。BCS患者均存在因肝静脉流出道阻塞所导致的淤血性肝脏损伤。这种肝脏损伤在急性期可表现为肝脏外周带的血液低灌注区及细胞水肿带,慢性期可表现为因长期肝脏淤血性损伤所导致的肝脏纤维化、肝硬化及肝癌等。BCS导致的淤血性肝脏损伤是一种特殊类型的肝脏损伤,与病毒、中毒、酒精及胆汁淤积等常见因素所导致肝脏损伤相比,有着不同的肝脏损伤机制,但具体损伤机制目前尚不清楚。在BCS病程中均存在肝脏淤血;同时长期肝脏淤血还可以导致肝细胞肿胀坏死,肝脏再生结节及纤维间隔形成,肠源性内毒素产生增多等现象;这些因素均可导致肝脏血流灌注减少,引起肝内缺氧。缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factors,HIFs)是体内最重要的缺氧敏感性核转录因子,其在体内所有组织细胞对缺氧稳态调节中均起关键的作用。在机体缺氧时,无氧代谢增加,可引起HIFs活化,激活靶基因:血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达增加,促进血管生成;同时还可导致诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达增加,发挥其扩张血管的作用,从而使缺氧的组织细胞保持氧稳态及耐受低氧状态。然而,HIFs过度表达可导致氧自由基生成增加,通过氧化应激反应,促进细胞凋亡,加重器官的损伤。丙二醛(Malonaldehyde,MDA)是反映氧化应激损伤最具代表性的指标。MDA可通过活化Kupffer细胞,使其分泌多种细胞因子,激活肝星状细胞,介导其分化、增殖和胶原合成,参与调节肝脏损伤。有研究报道显示核因子-κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)依赖机制的炎症反应参与调节病毒、中毒、酒精及胆汁淤积等各种因素导致肝脏损伤的进程。BCS患者也均存在门静脉高压,胃肠道血液回流障碍,肠道淤血水肿,肠道内菌群失调等,这些因素均可导致肠道产生及进入门静脉系统细菌内毒素(Lipopolysaccharides,LPS)增加。同时BCS患者还存在肝脏淤血缺氧性损伤,因此其肝脏对LPS代谢能力也有所下降。上述这些因素均可导致BCS患者肝脏组织内LPS蓄积,进而通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路激活肝脏组织内NF-κB依赖的炎性反应介导肝脏损伤的进程,但目前尚无此方面的研究证据。目的1.检测分析MDA、HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF在BCS动物模型中不同时间点肝脏组织中表达水平的变化,研究缺氧及缺氧敏感性核转录因子在BCS导致肝脏损伤进程中的调控机制。2.检测分析LPS、TLR4、NF-κB及其下游靶基因[肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-2(Interleukin-2,IL-2)及干扰素-γ(Interferon-γ,INF-γ)]在BCS动物模型中不同时间点肝脏组织中表达水平的变化,探讨NF-κB介导的炎症反应在BCS致肝脏损伤中的作用机制。材料与方法180只健康成年雄性SD大鼠,体质量205-260g,采用随机数字表法分为9个亚组,每个亚组20只大鼠,模型组和假手术组各4个亚组(1、3、6、12W亚组),其余一个亚组作为对照组。常规清洁饲养,室温15℃-25℃,湿度50%-60%。采用部分结扎下腔静脉法建立大鼠BCS模型。假手术组仅分离大鼠下腔静脉周围组织,未对下腔静脉予以结扎。对照组中大鼠未做任何干预,仅将健康SD大鼠同期饲养6W。各个亚组大鼠术后饲养至相应周龄时存活大鼠均超过12只,按照随机数字表法随机选取12只大鼠处死,开腹取肝左叶组织适量,分别用10%福尔马林和Bouin氏液固定,用于病理检测,余肝脏标本均置于液氮冷藏备用。所有大鼠在处死前一天均采用数字减影血管造影(Digital subtraction angiography,DSA)评价大鼠下腔静脉血流及周围侧枝血管形成情况。采用HE染色及Masson三色染色法观察大鼠肝脏病理改变。采用双抗体夹心法检测大鼠肝组织匀浆中MDA表达量。采用鲎试剂法检测肝组织匀浆中LPS的表达量。采用 RT-PCR 和 Weston-blotting检测 HIF-1α、HIF-2α、NF-κB、VEGF、iNOS、TLR4、TNF-α、IL-2及INF-y等相关指标在大鼠肝脏组织中mRNA及蛋白表达量。采用Levene法检验各组数据方差齐性。验证方差齐性后,各因子在模型组、假手术组及对照组,三组间的总体比较,采用单因素方差分析;模型组与假手术组两组间比较,采用两因素方差分析;各亚组间两两比较采用LSD检验。以Pearson法做各因子相关性分析,检验水准设为0.05,以P0.05为差异有统计意义。结果1.对照组及假手术组中所有大鼠下腔静脉及肝静脉血流通畅,未见狭窄或闭塞等血管阻塞性病变,亦未见下腔静脉周围侧枝血管形成。模型组中48只大鼠均存在肝静脉开口以上下腔静脉阻塞,其中35只(72.9%,35/48)肝静脉开口以上下腔静脉(即结扎处)呈重度狭窄,管腔狭窄率85%;另外13只(17.1%,13/48)肝静脉开口以上下腔静脉完全闭塞。模型组中1-12W亚组侧枝血管呈逐渐增多、增粗趋势,以12W亚组最为显著。假手术各亚组及对照组中大鼠肝脏病理染色均未见阳性表现。模型组中1W亚组大鼠肝脏亦未见明显阳性病理改变;3-12W各亚组肝脏均见不同程度淤血性损伤。模型组中3-12W各亚组大鼠肝脏淤血性损伤及肝脏纤维化程度呈逐渐加重趋势,以12W亚组最为显著。2.模型组术后第1、3、6、12W各亚组肝脏匀浆的MDA含量值分别为:(8.55±0.44)nmol/L,(9.63±0.75)nmol/L,(9.36±0.53)nmol/L和(9.13±0.62)nmol/L;均高于假手术组中对应亚组[(6.57±0.41)nmol/L,(6.67±0.48)nmol/L,(6.54±0.57)nmol/L和(6.62±0.46)nmol/L]及对照组(6.61±0.43)nmol/L,三组之间总体比较,差异有统计意义(F=213.6,P0.001);行组间两两比较发现,MDA在对照组中表达量与假手术各亚组组间差异均无统计学意义;而模型组中各亚组MDA表达量与模型组中其他亚组相比较,亚组间差异均有统计学意义;同时模型组中各亚组MDA表达量与假手术各亚组及对照组相比较,亚组间差异也均有统计学意义。对照组及假手术各亚组大鼠肝脏组织仅有基础水平的HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF的mRNA及蛋白表达。模型组中各亚组大鼠肝脏组织中各个因子的mRNA及蛋白表达量均明显高于对照组及假手术各亚组,各因子三组间的总体比较差异均有统计学意义(各因子mRNA统计量:F分别为:377.8、536.2、338.0和568.3;各因子蛋白统计量:F分别为:940.4,852.6,627.4和1054.2;P均0.001);行组间两两比较发现,各因子在对照组中表达量与假手术各亚组间差异均无统计学意义;而各因子在模型组中各亚组的表达量与模型组中其他亚组相比较,亚组间差异均有统计学意义;同时各因子在模型组中各亚组的表达量与假手术各亚组及对照组相比较,亚组间差异也均有统计学意义。模型组中各亚组MDA、HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF的表达量均在早期呈逐渐升高趋势,3W到达峰值,后期有所下降;但在12W仍明显高于对照组及假手术各亚组表达量。HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF的转录水平与相应蛋白合成均呈高度正相关(r=0 964,0.953,0.946及0.967;P均0.001)。大鼠BCS模型肝脏组织中HIF-1α、HIF-2α、iNOS和VEGF各个因子的mRNA及蛋白表达量均呈高度正相关,相关系数r均0.90,p均0.001。3.模型组术后第1、3、6、12W各亚组大鼠肝匀浆中LPS的含量值分别为:(1.16±0.08)ng/mL,(1.80±0.10)ng/mL,(1.31 ±0.09)ng/mL 和(1.23±0.10)ng/mL;均高于假手术组中对应亚组[(0.87±0.07ng/mL,(0.86±0.06)ng/mL,(0.85±0.07)ng/mL和(0.85±0.09)ng/mL]及对照组(0.86±0.08)ng/mL,三组间差异有统计意义(F=182.4,P0.001),行组间两两比较发现,LPS在对照组中表达量与假手术各亚组组间差异均无统计学意义;而LPS在模型组中各亚组的表达量与模型组中其他亚组相比较,亚组间差异均有统计学意义;同时LPS在模型组中各亚组表达量与假手术各亚组及对照组相比较,亚组间差异也均有统计学意义。对照组及假手术各亚组仅有基础水平的TLR4、NF-KB、TNF-α、IL-2及INF-γ的mRNA及蛋白表达。模型组中各亚组肝脏中各个因子的mRNA及蛋白表达量均明显高于对照组及假手术各亚组,各因子在三组之间总体比较,差异均有统计学意义(各因子mRNA统计量:F分别为:333.2、464.0、426.3、555.3和509.2,P均0.001;各因子蛋白统计量:F分别为:291.8、711.8、608.2、897.1和488.5,P均0.001);行组间两两比较发现,各因子在对照组的表达量与假手术各亚组间差异均无统计学意义;而各因子在模型组中各亚组的表达量与模型组中其他亚组相比较,亚组间差异均有统计学意义;同时各因子在模型组中各亚组表达量与假手术各亚组及对照组相比较,亚组间差异也均有统计学意义。模型组中各亚组LPS、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-2及INF-γ的表达量均在早期呈逐渐升高趋势,3W时到达峰值,后期有所下降,但直至12W时仍明显高于对照组及假手术各亚组表达量。TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-2及INF-γ的转录水平与相应蛋白合成均呈高度正相关(r=0 959,0.947,0.956,0.964及0.971;P均0.001)。肝脏中LPS表达量与TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-2及INF-γ各个因子的mRNA及蛋白表达量均呈高度正相关,相关系数r均0.90,P均0.001。结论1.采用部分结扎大鼠肝后段下腔静脉的方法,建立BCS动物模型,能够很好模拟BCS患者的临床表现、血管病变特征以及病理生理改变,可以为后期BCS基础研究提供平台。2.缺氧是BCS导致肝脏损伤一个重要因素和初始因素。3.在BCS导致肝脏损伤进程中,机体可通过活化肝脏组织中HIFs,调控靶基因(iNOS和VEGF)表达水平升高,诱导肝内外血管扩张并建立侧枝血管,缓解肝脏淤血缺氧,调控BCS导致肝脏损伤的进程。4.在整个BCS导致肝脏损伤进程中均存在NF-κB介导的炎症反应。5.LPS可激活TLR4-NF-κB信号转导通路,诱导TNF-α、IL-2及INF-γ等炎症因子的表达,介导肝脏炎性损伤,调控BCS导致肝脏损伤的进程。6.在BCS导致肝脏损伤的早期NF-κB介导的炎症反应呈进行性加重,后期随肝内、外侧枝血管的建立,炎症反应有所降低,但仍明显高于正常水平;这说明机体代偿生成侧枝血管可一定程度上缓解肝脏炎性损伤,但无法从根本上解决肝脏炎性损伤。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575
【图文】：

导管,布加综合征,开腹,周围组织

逑ｍｍ逡逑图２ａ逦图２ｂ逡逑１逡逑ｆｆｆ逡逑图２ｃ逦图２ｄ逡逑图２大鼠布加综合征模型制备图图２ａ开腹暴露肝上下腔静脉；图２ｂ分离肝上下腔静脉逡逑周围组织；图２ｃ用缝线将４Ｆ导管及下腔静脉一起结扎；图２ｄ撤出４Ｆ导管，随后逐层缝逡逑合关腹。逡逑４０逡逑

导管,布加综合征,开腹,周围组织

标准曲线,丙二醛,标准方程,标准曲线

图６大＿干匀装检测的丙二醛标准曲线标准方程为：Ｙ；０．１７９５４４．７７３７Ｘ，１＾邋＝邋０．９９８５

【参考文献】