乙肝病毒X蛋白及其截短体与损伤DNA结合蛋白1在HBV复制中的作用
发布时间：2020-08-09 08:53
【摘要】：背景：乙肝病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein，HBx）与损伤DNA结合蛋白1（damage-specific DNA binding protein1, DDB1)在乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）复制中发挥了重要作用。HBV基因组整合到宿主基因组过程中，HBx蛋白常常发生断裂不全，转录为HBx蛋白的截短体，既往多项研究表明HBx蛋白截短体对HBV的复制产生了一定的影响，并且不同截短长度、不同截短部位的截短体对HBV的复制产生的影响也不同。但是，HBx蛋白截短体是否通过影响DDB1水平来影响HBV复制至今尚无详细报道。 目的：我们的研究将进一步探讨HBx蛋白及其两个截短体（HBx1-101，HBx43-154）与DDB1在HBV复制中的作用。 方法：使用质粒瞬时转染HepG2细胞后，分别提取转染后72h细胞总RNA和细胞总蛋白，通过逆转录实时定量PCR和Western blot分析方法分别在DDB1基因的mRNA和蛋白水平观察HBx蛋白及其截短体对DDB1蛋白的影响。并通过质粒共转染瞬时转染HepG2细胞后，提取转染72h后各转染组细胞胞浆DNA，收集各转染组细胞的培养上清液，通过实时定量PCR及ELISA方法检测各组细胞HBV复制及病毒标志物表达水平，从而观察HBx蛋白及其两个截短体与DDB1对HBV复制的影响。 结果：在有HBV复制的HepG2细胞中，转染了HBx C-端截短体HBx1-101的细胞中DDB1蛋白的表达水平明显下降，且不能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中HBV的复制及病毒标志物表达恢复到野生型水平；而转染N-端截短体HBx43-154的细胞中DDB1蛋白表达水平与转染HBx的对照组相比无明显变化，且能使缺失HBx蛋白的HepG2细胞中HBV的复制及病毒标志物表达恢复到野生型水平。并且各转染组DDB1蛋白水平变化与HBV复制水平相平行，即DDB1蛋白水平的降低，使得HBV复制水平也相应降低。 结论：C-端53个氨基酸及DDB1蛋白对于HBV野生型水平的复制是必需的，而N-端42个氨基酸对于HBV复制水平无明显影响。C-端53个氨基酸对HBV复制的影响作用可能是通过影响DDB1蛋白水平实现的。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62
【图文】：
分别于转染HepG2细胞后24h，48h，72h在荧光倒置显微镜下观察细胞转染效率，发现转染48h后荧光蛋白表达水平最高，转染效率约35%。图2.1 转染 48小时后荧光显微镜下绿色荧光蛋白的表达Fig2.1 The expression of GFP after 48 h post-transfection under a fluorescence microscope
重庆医科大学硕士研究生学位论文2 筛选 DDB1-miRNA 质粒以 等 量 的 pcDNA6.2 -GW/ EmGFP-miR （ DDB1 ） 1,2,3 及 阴 性NA6.2 -GW/ EmGFP-miR 质粒转染 HepG2 细胞 72h 后提取等量细胞A，并进行逆转录实时定量 PCR 分析。结果发现转染 pcDNA6.2 GFP-miR（DDB1）2 的细胞中 DDB1 在 mRNA 水平上沉默效率最高(约为组的 41.05±2.61)%，于是选择其作为后续实验的干扰质粒。
图 2.3 DDB1 蛋白水平的 Western blot 分析1.pSI，2.pSI-X，3.pSI-X1-101，4.pSI-X43-154，5.DDB1-miRNA， blot analysis of DDB1 （Transfected with：Lane 1. pSI, Lane 4. pSI-X43-154, Lane 5. DDB1-miRNA, Lane 6. negative contro HBx 质粒转染组细胞的 DDB1 蛋白 mRNA 水平的析 pSI-X,pSI，pSI-X1-101，pSI-X43-154分别转染 HepG2 细并以等质量 RNA 进行逆转录实时定量 PCR 分析，结I-X1-101转染组细胞中 DDB1 mRNA 水平分别降至 p4）%、（43.16±2.20）%，而 pSI-X43-154转染组细胞中变。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62
【图文】：
分别于转染HepG2细胞后24h，48h，72h在荧光倒置显微镜下观察细胞转染效率，发现转染48h后荧光蛋白表达水平最高，转染效率约35%。图2.1 转染 48小时后荧光显微镜下绿色荧光蛋白的表达Fig2.1 The expression of GFP after 48 h post-transfection under a fluorescence microscope
重庆医科大学硕士研究生学位论文2 筛选 DDB1-miRNA 质粒以 等 量 的 pcDNA6.2 -GW/ EmGFP-miR （ DDB1 ） 1,2,3 及 阴 性NA6.2 -GW/ EmGFP-miR 质粒转染 HepG2 细胞 72h 后提取等量细胞A，并进行逆转录实时定量 PCR 分析。结果发现转染 pcDNA6.2 GFP-miR（DDB1）2 的细胞中 DDB1 在 mRNA 水平上沉默效率最高(约为组的 41.05±2.61)%，于是选择其作为后续实验的干扰质粒。
图 2.3 DDB1 蛋白水平的 Western blot 分析1.pSI，2.pSI-X，3.pSI-X1-101，4.pSI-X43-154，5.DDB1-miRNA， blot analysis of DDB1 （Transfected with：Lane 1. pSI, Lane 4. pSI-X43-154, Lane 5. DDB1-miRNA, Lane 6. negative contro HBx 质粒转染组细胞的 DDB1 蛋白 mRNA 水平的析 pSI-X,pSI，pSI-X1-101，pSI-X43-154分别转染 HepG2 细并以等质量 RNA 进行逆转录实时定量 PCR 分析，结I-X1-101转染组细胞中 DDB1 mRNA 水平分别降至 p4）%、（43.16±2.20）%，而 pSI-X43-154转染组细胞中变。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 刘晓红,朱明华,曹晓哲,郑建明,陈颖;HBx蛋白羧基端缺失对肝癌细胞生物学行为的影响[J];癌症;2005年10期
2 张玉霞;徐菲;张旭照;;慢性HBV感染肝组织的C端截短型HBx蛋白功能研究[J];中国肿瘤;2008年12期
3 彭R
本文编号：2786896
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/2786896.html
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