外周血单核细胞表型及功能与慢性乙型肝炎免疫低下的相关性研究

发布时间：2020-08-17 09:32

【摘要】： 慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)在我国是一种严重危害人类身体健康的传染性疾病，有近3500万的CHB患者。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染慢性化及其持续感染机制尚未完全阐明，故而临床上缺乏针对CHB的有效治疗方法。HBV感染慢性化机制复杂，HBV感染时机体免疫功能低下以致不能有效清除病毒是主要原因。功能性T细胞损伤是HBV持续感染的重要特征。T细胞被激活需要双刺激信号，均由抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)提供。巨噬细胞(macrophage，MΦ)和树突状细胞(dendritic cell，DC)是专职的APC，DC还能够启动初始T细胞的免疫应答。单核细胞(Monocyte，Mo)则是巨噬细胞(macrophage，MΦ)和树突状细胞(dendritic cell，DC)的前体细胞，在淋巴细胞的极化和增殖中发挥重要的作用，同时能够决定人体与小鼠的初始及记忆性T细胞的反应格局。 Mo不但在适应性免疫中扮演重要角色，在固有免疫中也发挥重要作用。Mo具有多种Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)，如表面的TLR2和TLR4等，胞内有TLR3等受体表达，能够感知外来抗原。细胞外信号可以被转换成胞内的生化事件，引起基因的转录激活和产物表达。单核细胞发挥作用除了可以通过细胞的直接作用或表面受体外，还可以分泌相关的细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukine-6，IL-6)、IL-10和IL-12等。目前对Mo的研究正处于起步阶段；国内外都缺乏有关HBV慢性感染时Mo的系统性研究资料。因此，了解Mo的功能状态非常必要。本课题中，我们以Mo与HBV慢性感染时机体免疫功能低下的相关性为研究目的，从Mo对抗原感知，免疫应答和免疫调节三个阶段开展研究。第一部分慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞亚群及TLR表达分析目的研究慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞的比例、CD14~(low)CD16~+亚群及表面TLR2、TLR4的表达量，探讨单核细胞的CD14~(low)CD16~+亚群及TLR与HBV慢性感染之间的相关性。方法设立慢乙肝组(CHB组)和正常对照组(N组)。在慢乙肝组中筛选慢性乙型肝炎患者20例，未经任何抗病毒或免疫调节剂治疗，除外其他肝脏疾病及自身免疫性疾病；对照组中以12例健康者作对照。取外周抗凝血1ml，用流式细胞仪测定外周血Mos及CD14~(low)CD16~+亚群的比例和TLR2、TLR4的表达量。结果慢性乙型肝炎患者外周血中Mo的比例为8.53±2.39％，较之对照组的6.22±1.16％有明显增高(P＜0.05)。Mo亚群CD14lowCD16+在总Mo中所占的比例为14.56±7.31％，明显高于对照组的10.47±4.80％(P＜0.05)；慢乙肝组中表达TLR2的Mo比例为77.15±13.78％，平均荧光密度(mean flurescence intensity，MFI)为1358.12±612.49；对照组TLR2的Mo阳性率为77.02±8.31％，MFI为1322.15±251.02，两组比较无显著差异(p＞0.05)；慢乙肝组Mo的TLR4阳性率为76.88±10.27％，MFI 700.9±428.75；对照组的Mo TLR4阳性率是77.84±6.25％，MFI为614.0±235.64。两组之间比较TLR4的Mo阳性细胞表达率及MFI进行比较，显示差异无统计学意义(p＞0.05)。结论 1．慢乙肝患者的外周血Mo比例及亚群CD14lowCD16+比例明显升高，提示单核细胞与HBV慢性感染有相关性； 2．慢乙肝患者外周血Mo表面的TLR2和TLR4的表达并没有明显改变，提示Mo的TLR2和TLR4可能与HBV的慢性进展关联较小。第二部分慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞的B7-H1及CD155转录水平的分析目的研究慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞中，B7-H1和CD155的mRNA表达水平变化，探讨单核细胞在慢乙肝患者T细胞功能缺陷中的作用。方法设立CHB组和N组。在CHB组中筛选慢性乙型肝炎患者16例，未经任何抗病毒或免疫调节剂治疗，除外其他肝脏疾病及自身免疫性疾病；N组中以10例健康者作对照。从患者外周血中分离出单核细胞，以脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激，分别在刺激后0h、6h和24h收集细胞，制备总RNA，以Real-time PCR方法检测B7-H1和CD155 mRNA的表达水平。结果慢性乙型肝炎患者Mo在LPS刺激前，B7-H1 mRNA量为0.85±0.14，对照组在刺激前Mo的B7-H1 mRNA量为1.35±0.28，两组之间比较无显著统计学差异(p＞0.05)。LPS刺激6h后，慢乙肝组的B7-H1 mRNA量上升至1709±598.9，对照组则升至3179 1015，两组之间比较无明显差异(p＞0.05)；LPS刺激后24h，慢乙肝组的B7-H1 mRNA量是1271±492.3，而对照组的mRNA量是1716±535.84，差异无统计学意义(p＞0.05)。慢性乙型肝炎患者Mo在LPS刺激后6h，BT-H1的mRNA表达水平较刺激前有明显升高，差异具统计学意义(p＜0.05)，但24h后未有继续升高；对照组的mRNA表达水平在LPS刺激后6h较刺激前有明显上升，差异具有显著性(p＜0.05)，但是，刺激24h后B7-H1的mRNA表达水平有明显下降，但差异无统计学意义(p＞0.05)；慢性乙型肝炎患者Mo在LPS刺激前，CD155 mRNA量为1.52±0.49，对照组在刺激前，MoCD155的mRNA量为1.34±0.30，两组之间比较无明显统计学差异(p＞0.05)；LPS刺激后6h，慢乙肝组的CD155 mRNA量为1.97±0.41，而对照组为1.31±0.09，两组无明显差异(p＞0.05)；LPS刺激后24h，慢乙肝组的CD155mRNA量为3.56±0.14，对照组为6.30±1.30，比较无差异(p＞0.05)。慢性乙型肝炎患者Mo在LPS刺激后6h，CD155的mRNA表达水平较刺激前无明显变化，但是刺激24h后，CD155 mRNA的表达显著升高，差异具统计学意义(p＜0.05)；正常对照组中Mo的CD155 mRNA水平，在LPS刺激后6h较刺激前无明显变化(p＜0.05)，但在刺激24h后，CD155的mRNA水平有明显升高，差异具有显著性(p＜0.05)。结论 1．提示B7-H1和CD155与T细胞的功能受抑制无明显相关性； 2．B7-H1和CD155为T细胞抑制性受体的配体，在LPS的刺激后表现为特征各异的时序性，可能是在不同的阶段发挥作用。第三部分慢乙肝患者外周血单核细胞LPS刺激后功能分析目的研究观察慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞在LPS刺激后，分泌TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12的情况，探讨单核细胞在HBV慢性感染时炎症反应能力及对T细胞功能的影响。方法设立CHB组和N组。CHB组中筛选慢性乙型肝炎患者16例，未经任何抗病毒或免疫调节剂治疗，排除其他肝脏疾病及自身免疫性疾病；N组中以10例健康者作对照。从外周血中分离出单核细胞，以LPS刺激，刺激后0h、6h及24h分别收集细胞培养上清液，用ELISA方法检测不同时间点TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12的浓度。结果 1．TNF-α的ELISA结果： 1．1．两组间比较：LPS刺激前，CHB组TNF-α浓度为38.83±7.69 pg／ml，N组是35.40±7.72 pg／ml，两组间没有明显差异(p＞0.05)；刺激后6h，CHB组浓度升至5654±1350 pg／ml，N组为10320±51.05 pg／ml，N组显著高于CHB组(p＜0.05)；刺激后24h，CHB组TNF-α浓度为6384±175.9 pg／ml，N组是14770±780.0 pg／ml，明显高于CHB组，差异有统计学意义(p＜0.05)； 1．2．不同时间点的比较：CHB组中，LPS刺激后6h的TNF-α浓度显著高于LPS刺激前(p＜0.05)；N组中，LPS刺激后6h的TNF-α浓度也显著高于刺激前(p＜0.05)，刺激后24h的浓度较刺激后6h有显著升高(p＜0.05)。 2．IL-6的ELISA结果： 2．1．两组间比较：LPS刺激前，CHB组的浓度为1.804±0.60 pg／ml，N组是1.103±0.76 pg／ml，两组之间没有显著差异(p＞0.05)；刺激后6h，CHB组的IL-6浓度升至1133±68.91 pg／ml，N组为1069±26.93 pg／ml，两组差异不显著(p＞0.05)；刺激后24h，CHB组IL-6浓度为1084±11.81 pg／ml，N组的浓度是1600±16.79 pg／ml，对照组明显高于CHB组，差异有显著性(p＜0.05)； 2．2．不同时间点的比较：慢乙肝组中，LPS刺激后6h的IL-6浓度明显高于LPS刺激前，差异有统计学意义(p＜0.05)；对照组中LPS刺激后6h的IL-6浓度明显高于刺激前，差异有统计学意义(p＜0.05)，LPS刺激后24h的IL-6浓度较刺激后6h的浓度也有显著升高(p＜0.05)。 3．IL-10的ELISA结果： 3．1．两组间比较：LPS刺激前，CHB组的浓度为4.61±2.01 pg／ml，N组是13.14±4.39 pg／ml，两组之间没有明显统计学差异(p＞0.05)；刺激后6h，CHB组的IL-10浓度升至380.4±66.4 pg／ml，N组则为861.4±157.8 pg／ml，对照组明显高于慢乙肝组(p＜0.05)；刺激后24h，CHB组IL-10浓度为4241±914pg／ml，N组的浓度是2214±557.2 pg／ml，组间比较无差异(p＞0.05)； 3．2．不同时间点的比较：慢乙肝组中，LPS刺激后6h浓度明显高于刺激前(p＜0.05)，LPS刺激后24h的IL-10浓度明显高于刺激后6h(p＜0.05)；正常对照组中，LPS刺激后6h的IL-10浓度明显高于LPS刺激前，差异有统计学意义(p＜0.05)，刺激后24h的浓度较刺激后6h的浓度也有显著升高(p＜0.05)。 4．IL-12的ELISA结果： 4．1．两组间比较：LPS刺激前，CHB组的浓度为8.87±1.70 pg／ml，N组是9.78±0.65 pg／ml，组间比较无差异(p＞0.05)；刺激后6h，CHB组的IL-12浓度升至21.40±2.96 pg／ml，N组则为21.70±13.23 pg／ml，组间比较无差异(p＞0.05)；刺激后24h，CHB组IL-12浓度为11.03±0.37 pg／ml，N组的浓度是16.80±1.56 pg／ml，组间比较无差异(p＞0.05)； 4．2．不同时间点的比较：慢乙肝组中，LPS刺激后6h的IL-12浓度明显高于LPS刺激前，差异有统计学意义(p＜0.05)；对照组中，LPS刺激后6h的IL-10浓度明显高于刺激前，差异有统计学意义(p＜0.05)。结论 1．LPS刺激后，单核细胞有TNF-α、IL-6、IL-10分泌，且呈时间依赖性； 2．单核细胞受LPS诱导后有IL-12分泌，在刺激6h后达高峰； 3．HBV慢性感染时，单核细胞功能有障碍，表现为炎性细胞因子分泌的减少。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R512.62
【图文】：

外周血单核细胞,流式细胞仪检测,单核细胞

在流式仪上，根据颗粒度(SSC)及细胞大小(FSC)，可以将外周血中的白细胞分为二大群，自上而下依次为中性粒细胞(SSC最大)、单核细胞(SSC居中)和淋巴细胞(SSC最小)(图1一1a)。以方框圈定待测的单核细胞(图1一lb中的P1)，以备下一步的检测，数据显示单核细胞约占白细胞总数的6%(见图1一1)。NNNNNNNNNNNNNNNNN·TU匕 e00222……嘴畜 ----{OOOJ:谋之:〕、:二及皿........口兄只， ).PP!仍仍闷劣)了·?·万、，邢硕口......丙祝窗分、卜 ...。。(脚黔一…，‘.， :{{{幼幼1的，佃洲】2钧钧 FFFSC一A今1.咖 )))NNNNNNNNNNNNNNNNNNN一TU匕8800222222222222222222222222222…… 咬飞、·厂少3高山二.飞牡嘴砚价从了.少’气气气.....:::、、飞滩，户沁仓已七;1孚沙越获多价卜犷少 :的的………笋 FSC一A(x

荧光素标记,单核细胞,抗体,分选

以未加任何抗体的细胞为阴性对照，确定CD14抗体未标记细胞的阴性范围(如图Za所示Q3一6)，以Perep/eys.5荧光素标记的CD14抗体分选出阳性单核细胞(如图2b所示Ql一6)，结果显示单核细胞的比例约900/0。(见图1一2)。耽耽耽耽耽耽耽耽耽耽耽耽卜 Nlll一一全厂万弓习QZ· 66666月月‘三侧 1.............的的日 3---15Q41一 66666空空 1}}}}}}}}}}}}}}}}}}}甲甲 ._1}}}}几几呈习01石Q夕· 6111望望月一 r---...田田1月 ...QQQ-心攘巧习习刁刁了 0tD一tD一 1010--- PPPE一 AAAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCh· Cd1444::::矛习 !!!弓QZ· 66666】】、l，习肥砚乙l，，，甲甲。1遥必 1Q41一 66666几几旦闷，加汾01书O，.只 lll瓮瓮一到拼、一[一 lllDDD-尸艺刻李，彬彬 PPPE一 AAA图1一 2Percp/cys.5荧光素标记的cD14抗体分选出阳性单核细胞a.CD14荧光抗体未标记的单核细胞群(Q3一6);b.CD14荧光抗体标记阳性的单核细胞群(Ql一6)，显示阳性细胞比例约为90%。2.3.通过CD14抗体及CD16抗体双标记

抗体,双标记,单核细胞

【引证文献】