显性负性突变体融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN抑制乙肝病毒复制的研究

发布时间：2020-08-22 20:00

【摘要】：背景病毒性疾病是人类健康面临的严重威胁。在许多老的病毒性疾病时有发病的同时,新的病毒,特别是致死性强的新毒株不断出现,有的甚至会形成暴发式流行。在新出现的病毒性传染病面前,人群缺乏免疫力,而且短时间内也找不到有效的预防、治疗和控制办法。临床上使用的抗病毒治疗药物(干扰素)虽然疗效明显,但是存在一定的副作用。基因治疗策略在体外具有明显的抑制病毒复制作用,充分发挥基因治疗的抗病毒优势,建立一种能促使治疗分子高效、靶向进入病毒感染细胞的在体给药方法具有十分重要的意义,但由于缺乏有效特异的输送载体,基因治疗抗病毒策略未得到深入研究。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPP)可以高效的跨过细胞膜并把所携带的生物活性分子运送至细胞内。HBV表面蛋白PreS2结构域中包含一段具有CPP特性的转位基序(translocation motif, TLM),位于41-52氨基酸(PreS2-TLM), PreS2-TLM可不依赖于受体和转运蛋白非能量依赖性地将与其融合表达的蛋白带入细胞质内。单链抗体(single chain Fv, ScFv)分子量虽小,但是保留了与抗原结合的特异性,将治疗分子与ScFv进行偶联或融合后可引导治疗分子高浓度靶向聚集于抗原表达的细胞表面。基因治疗中,为了保证治疗分子的靶向结合和高效性进入靶细胞,可将CPP和特异性ScFv融合构成可穿过细胞膜的抗体,即靶向穿膜体。在HBV感染的肝细胞表面表达有HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg),针对HBsAg的抗体可高效特异地与其结合。在现有的几种HBV基因治疗策略中,HBV核心蛋白显性负性突变体体外抑制病毒复制的效率最高。所以,本研究以HBV为研究对象,探索一条靶向抑制HBV复制的新途径,从而为已有的、及未来可能出现的难治性病毒性疾病探索一条新的治疗思路。方法利用分子克隆与DNA重组技术,构建在真核细胞内表达的重组质粒pPreS2-TLM-ScFv-EGFP;以限制性内切酶与DNA测序鉴定重组质粒；以转染级质粒抽提试剂盒对质粒进行抽提与纯化；用脂质体2000转染质粒至中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO),以Zeocin筛选稳转细胞株；用荧光显微镜观察稳转细胞内融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的表达；用流式细胞仪测定表达PreS2-TLM-ScFv-EGFP融合蛋白的细胞阳性率；以Western blot检测细胞培养上清中的融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP;以含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的上清分别孵育HepG2.2.15、HepG2与HeLa细胞,以Texas标记的抗GFP单克隆抗体通过免疫荧光染色检测融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP在HepG2.2.15细胞内的定位；以激光共聚焦显微镜观察免疫荧光的染色结果；利用PCR与DNA重组技术构建HBc显性负性突变体HBcDN和重组质粒pPreS2-TLM-ScFv-HBcDN;以限制性内切酶与DNA测序鉴定重组质粒；用脂质体2000转染重组质粒pPreS2-TLM-ScFv-HBcDN入CHO细胞,以Zeocin和有限稀释法筛选表达融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的稳定细胞株；以DNA与RNA抽提试剂盒提取并纯化稳转细胞内的总DNA与总RNA,分别作为PCR与RT-PCR的模板,以插入片段的特异性引物分别扩增HBcDN, PreS2-TLM-ScFv与PreS2-TLM-ScFv-HBcDN,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；用Western blot检测融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的表达；收集含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的细胞上清孵育HepG2.2.15细胞；参考文献报道方法提取HepG2.2.15细胞内病毒的核心颗粒,以RNA抽提试剂盒纯化核心颗粒内包装的HBV前体RNA,以相对定量RT-PCR的方法分析核心颗粒内包装的HBV前体RNA水平。结果用DNA序列比对软件EditSeq将阳性克隆质粒的测序结果与已知的序列进行比对分析显示编码融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的序列完全正确。荧光显微镜观察结果表明融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP主要分布在稳转细胞的细胞质内。流式细胞仪测定结果显示稳定表达融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP的细胞阳性率为83.47±6.05%。Western blot检测结果表明细胞培养上清中含有融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP。激光共聚焦显微镜显示的免疫荧光结果表明Texas标记的抗GFP单克隆抗体在融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-EGFP孵育过的HepG2.2.15细胞内有明显的染色且HepG2.2.15细胞内的总荧光强度明显高于HepG2、HeLa细胞内的总荧光强度。用DNA序列比对软件EditSeq将阳性克隆质粒的测序结果与已知的序列进行比对分析显示融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的编码序列完全正确。稳定表达融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN的细胞命名为CHO-HBcDN,琼脂糖凝胶电泳结果显示分别以CHO-HBcDN细胞的总DNA与总RNA为模板的PCR与RT-PCR均获得了与插入片段大小对应的条带。Western blot结果表明在CHO-HBcDN细胞培养上清液中检测到融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN。定量RT-PCR结果的比较分析表明当HepG2.2.15细胞暴露于上清24、48与72h时,体积占培养基总体积25%的CHO-HBcDN上清,能够显著抑制HBV前体RNA的包装；当HepG2.2.15细胞暴露于上清72h时,12.5%的CHO-HBcDN上清也能够显著抑制HBV前体RNA的包装。结论本研究中,PreS2-TLM-ScFv-EGFP融合蛋白在CHO细胞内稳定表达后分泌到细胞培养上清；上清中的PreS2-TLM-ScFv-EGFP能够特异性地穿透至HepG2.2.15细胞的细胞质内；PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白在CHO细胞内稳定表达并分泌到细胞培养上清；上清中的PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白能够抑制HepG2.2.15细胞内乙肝病毒前体RNA在核心颗粒内的包装；细胞上清中含有的PreS2-TLM-ScFv-HBcDN融合蛋白对HepG2.2.15细胞内HBV复制的抑制作用与HepG2.2.15细胞暴露于上清的浓度和时间有关。25%的上清是抑制病毒复制的最佳浓度。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

【参考文献】