转基因乳酸杆菌联合5-氨基水杨酸对实验性结肠炎小鼠肠道炎症及免疫调节影响的研究

发布时间：2020-08-25 06:12

【摘要】：背景与目的 炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)是一组病因不明的慢性、易复发性肠道炎症疾病,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's Disease, CD),本病在我国近20年的发病率呈上升趋势。 乳酸杆菌在促进肠道菌群平衡,调节肠粘膜免疫功能和增强肠粘膜屏障、防御病原方面起着重要作用。白细胞介素-10(IL-10)又名细胞因子合成抑制因子,是典型的抗炎与免疫抑制性细胞因子,在炎症性肠病的发展中起着重要的作用,同时在诱导型Treg细胞的诱导和CD4+ CD25+调节性T细胞的长期生存、抑制机制的维持中发挥比较重要的作用。 本实验将IL-10基因导入乳酸杆菌并表达,并将其用于硫酸葡聚糖钠(dextran sodium sulphate, DSS)造模小鼠的治疗,观察其对小鼠肠道炎症的影响,对其作用机制进行了初步探讨。 方法 第一部分构建表达白介素10(IL-10)的重组乳酸杆菌 人工合成信号肽系列与IL-10基因连接后克隆到干酪乳酸杆菌(lactobacillu casei, L. casei)整合型表达载体pIlac的lac启动子下游,得到重组质粒pIlac-sp-IL10,电穿孔转化L. casei CECT 5276。挑选转化后的耐药菌落在含红霉素培养基中培养,抽提染色体DNA, PCR及测序鉴定证实IL-10基因是否整合到干酪乳酸杆菌的基因组中,Western blot检测重组蛋白表达。第二部分转IL-10乳酸杆菌联合5-氨基水杨酸对实验性结肠炎小鼠肠道炎症的影响及机制的初步探讨 将实验小鼠分为七组,正常对照组,DSS造模组,DSS造模+5-ASA治疗组,DSS造模+乳酸杆菌组(菌液2×108CFU/ml)+5-ASA治疗组；DSS造模+低剂量转IL-10乳酸杆菌组(菌液2×107CFU/ml)+5-ASA治疗组；DSS造模+中剂量转IL-10乳酸杆菌组(菌液2×108CFU/ml)+5-ASA治疗组；DSS造模+高剂量转IL-10乳酸杆菌组(菌液2×109 CFU/ml)+5-ASA治疗组。于试验第十一天将小鼠处死,观察指标包括小鼠一般情况,结肠长度,结肠组织病理学评分(histopathological score, HS),疾病活动指数(disease activity index, DAI)等,并分别对小鼠外周血行pCR检测NF-κB、PPAR-γ、IFN-γ、TGF-β、IL-10,结肠粘膜组织行western blotting检测PPAR-γ/IFN-γ、TGF-β、IL-10水平。 结果 第一部分 成功将IL-10基因整合到干酪乳酸杆菌的基因组中；转基因乳酸杆菌产生的目的蛋白部分分泌进入培养上清。 第二部分 1浓度2×108CFU/ml的转IL-10乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠肠道炎症的改善优于2×108CFU/ml的乳酸杆菌(P0.05)； 2三种浓度(2*107CFU/ml,2*108CFU/ml,2*109CFU/ml)的转IL-10乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠肠道炎症改善效果不一：浓度越高,效果越明显。 结论 转IL-10乳酸杆菌对实验性结肠炎小鼠肠道炎症缓解有一定效果,效果和浓度有关。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R574.62
【图文】：

复旦大学攻读硕士学位研究生毕业论文而后使其自然冷却);(lD将胶从染色液中取出，放入新的平皿中，用水轻轻冲洗数次，倒入在摇床上平稳摇动6、sh，其间更换洗脱液3次(或者每次用微波炉加脱色会更快且不需摇床);(l3)待完全脱色后，用清水冲洗数次，用凝胶系统照相。WesternBloting实验流程:·胶的处理:小心将胶放入100mL阴极buffer，平衡15min·膜的处理:用尺子量作胶的大小，剪同样大小的一片PVDF膜，用%)浸泡155，再用双蒸水浸泡Zmin，取出用阳极b。fferl工平衡IOm·半干法转膜:按下面顺序放胶、膜和滤纸，插上电源，1.ZfnA/c耐转

一4工L一10与信号肚拼接的PCR电泳图经纯化后与p工Lac空载体同时进行酶切，杆菌，获得阳性克隆后电转化乳酸杆菌定，鉴定电泳图如下1234M15001DDO900800700600500400e00

分子量与工L一10蛋白相符，而原始菌的电泳则无相应的蛋白条带(图1一6)，说明工L一10在干酪乳酸杆菌中得到了分泌表达。3.儿一10在L.casei中的表达的稳定性将工程菌在无选择压力条件下培养50代并冻存，菌液抽DNA做PCR仍可检测到工L一10基因，接种的菌液在乳糖诱导后仍可分泌工L一10，培养物进行dot一blot仍可检测到工L一10表达。第29页

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 熊亚明;潘善培;陈敬;黄丹;关艺青;;构建表达猪卵透明带抗原(pZP3α)的重组乳酸杆菌[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2009年02期

2 王红梅,李大金,姜红,袁正宏;hCGβ在乳酸杆菌中的分泌性表达[J];生殖与避孕;2003年03期

3 姚晓英;李大金;袁敏敏;;hCGβ-C3d3融合蛋白在乳酸杆菌的表达及鉴定[J];生殖医学杂志;2006年05期

本文编号：2803364