第一部分慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞表面的PD-1表达及其影响因素的研究 目的研究慢性乙型肝炎患者外周血外周血单个核细胞、CD4+T、CD8+T淋巴细胞表达PD-1的情况以及影响PD-1表达的可能的因素。 方法密度梯度离心法分离63例慢性乙型肝炎患者(其中包括HBeAg(+)患者32例,HBeAg(一)患者31例)、35例乙肝病毒健康携带者、18例健康人外周血单个核细胞、CD4+T、CD8+T淋巴细胞中表达PD-1的百分比,分析慢性乙型肝炎患者、乙肝病毒健康携带者及健康人PD-1表达的差异；观察PD-1表达与HBV感染者ALT水平、乙肝e抗原、病毒复制指标HBV-DNA水平之间的关系。 结果HBV健康携带组外周血单个核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率最高；CHB组次之；健康对照组最低。HBV健康携带组外周血单个核细胞、CD4+T淋巴细胞上PD-1表达显著高于健康对照组及CHB组,CHB组显著高于健康对照组(P0.05)。而CD8+T淋巴细胞上PD-1表达只在健康对照组和HBV健康携带组之间比较差异显著(P0.05),其他组间比较均无统计学差异。CHB患者外周血单个核细胞、CD4+T、CD8+T淋巴细胞上表达PD-1百分比与血清ALT及HBV-DNA水平无相关性。CHB患者eAg是否阳性对PD-1在外周血单个核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞表面表达率有一定影响：HBeAg(+)组和HBeAg(-)组外周血单个核细胞表面表达PD-1比率分别为：25.88±20.09%和15.39±10.64%,较健康对照组(10.85±4.45%)明显升高,HBeAg(+)组和健康对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)；HBeAg(+)组PD-1表达比率显著高于HBeAg(-)组,P0.01。HBeAg (+)组、HBeAg(-)组、健康对照组CD4+T淋巴细胞表面表达PD-1表达率分别为：9.15±6.46%、8.65±6.84%、2.37±1.16%,HBeAg(+)组及HBeAg(-)组健与康对照组CD4+T淋巴细胞表面PD-1表达率比较,差异均有统计学意义,P0.01。HBeAg(+)组、HBeAg(-)组、健康对照组CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率分别为：3.71±2.79%、3.23±2.39%、1.40±0.31%,HBeAg(+)组及HBeAg(-)组健与康对照组CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率比较,差异有统计学意义,P0.05。 结论CHB患者外周血单个核细胞、CD4+T淋巴细胞上PD-1表达显著高于健康人,又明显低于HBV健康携带者。PD-1表达可能与HBV感染者的免疫状态相关。血清HBeAg可以明显影响CHB患者外周血T单个核细胞表面PD-1的表达,是影响其PD-1表达的重要因素。 第二部分淋巴细胞系Molt-4细胞PD-1启动子区域甲基化水平和PD-1表达的关系的研究 目的以T淋巴细胞株Mo1t-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-Zac)对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(PD-1)基因启动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间关系。方法以不同浓度的5-Zac(0μmol·L-1、5μmol·L-1、10μmo1·L-1)作用于体外培养的molt-4细胞72h,流式细胞术(FCM)检测细胞表面表达PD-1的Molt-4细胞比例和细胞凋亡率；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测5-Zac作用后PD-1基因mRNA的转录水平；亚硫酸氢钠处理各组Molt-4细胞DNA, PCR扩增PD-1启动子基因片段,转化感受态大肠杆菌,挑克隆测序,检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态。 结果0μmol·L-I、5μmol·L-1、10μmol·L-1的5-氮杂胞苷作用于molt-4细胞72h后,PD-1在细胞表面的表达率分别为：1.13±0.01%；18.96±1.87%；63.09±6.25%,并呈现浓度依赖性；PD-1基因mRNA表达量显著增加；细胞凋亡检测结果显示与未处理组相比,加5μmol·L-1、10μmo1·L-1的5-氮杂胞苷处理72h后molt-4细胞的凋亡率显著增加,三组凋亡率分别为：1.9%+0.06%；8.98%+1.36%；24.5%+3.68%,有显著性差异(P0.01)；三组DNA亚硫酸氢钠测序结果表明,加入甲基化抑制剂5-Zac处理后,PD-1启动子上-601bp和d-553bp CG点去甲基化程度明显增高。 结论甲基化抑制剂5-Zac可导致体外培养的T淋巴细胞系Molt-4细胞表面程序性死亡受体-1(PD-1)表达显著增加,PD-1基因mRNA表达增加,细胞凋亡率增高,这种增高可能与PD-1基因启动子区域出现的低甲基化有关。 第三部分慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞PD-1基因启动子区域甲基化状态及影响因素 目的探讨慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞上程序性死亡受体-1表达和PD-1启动子区域甲基化水平的关系,以及HBeAg对慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞表面PD-1基因启动子区域甲基化状态的影响 方法筛选健康对照组10例、慢性乙型肝炎患者HBeAg阳性者10例、慢性乙型肝炎患者HBeAg阴性者10例,实时定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测外周血单个核细胞中PD-1基因的mRNA表达水平；亚硫酸氢钠处理PBMCs细胞DNA, PCR扩增PD-1启动子基因片段,转化感受态大肠杆菌,挑克隆测序,检测扩增的PD-1启动子片段甲基化状态。 结果与正常对照组(0.10±0.023)比较,慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中PD-1mRNA表达水平明显升高。在慢性肝炎患者中,外周血单个核细胞上PD-1表达在HBeAg阳性患者(0.44±0.046)中显著高于HBeAg阴性患者(0.18±0.014)。PD-1启动子上多个CpG点(-601、-553、-538、-483、-463、-317)甲基化程度与PD-1在单个核细胞上的表达呈负相关；PD-1启动子上-553bp、-538、-483CpG位点甲基化程度与血清中e抗原可能存在相关性。 结论PD-1基因启动子区域甲基化水平可能影响慢性乙肝患者外周血单个核细胞上PD-1表达；其基因启动子甲基化状态可能受到乙肝病毒e抗原影响。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R512.62
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