Caspase-1信号通路在重症急性胰腺炎肠黏膜屏障损伤保护中作用和分子机制研究

发布时间：2020-09-12 10:11

　　背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上常见急腹症之一。轻症急性胰腺炎(mildpancreatitis,MP)预后较好,临床上约有20%病例会发展到重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),病情凶险,早期就会发生急性炎症反应综合征(systemic inflammatory response sysdrome,SIRS),进一步还会发展成为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction sysdrome,MODS)。尽管诊断方法和治疗手段不断改进,死亡率仍然高达20%以上。更重要的是,从轻症发展到重症的启动机制尚未完全明确。中医研究认为“通里攻下”在控制SAP早期发展过程中起到非常重要的作用。传统中药大黄有多种活性成分和广泛的药理作用,其“通下”、消炎和改善血液循环的功能在重症急性胰腺炎治疗中发挥重要作用,但具体作用机制尚未明确。大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌,Emodin)是一种由大黄提取纯化而来的蒽醌类化合物,可作为有效单体参与大黄对胃肠道粘膜保护机制的研究。已有研究表明急性胰腺炎早期炎症因素可以促发肠粘膜屏障的损害,随后引发的肠道细菌内毒素释放入血液循环,可促发炎症因子(如IL-1β、IL-18等)爆发式释放,会引起肠道及全身多脏器的损伤和功能衰竭,而这正是重症急性胰腺炎高致死性和致残率的原因。有研究表明作为IL-1β活性转化酶(interleukin-1 beta-converting enzyme,ICE)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteiny1 aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)在重症急性胰腺炎的炎症因子激活和爆发过程中起到一个关键的枢纽作用,研究caspase-1参与重症急性胰腺炎反应的具体途径,以及大黄素是否通过抑制caspase-1的表达,影响caspase-1相关炎症信号通路的炎症因子和炎症介质的释放,达到修复受损肠粘膜屏障的功效,减少细菌和内毒素通过肠粘膜屏障进入血液循环产生“二次打击”,进而起到治疗重症急性胰腺炎的功效。相关研究成果会对明确大黄素治疗重症急性胰腺炎的作用机制有所帮助。目的:本研究以caspase-1信号通路为研究途径,通过SAP动物模型为实验载体,以大黄素和caspase-1拮抗剂作为两个干预因素,研究Caspase-1信号通路在SAP大鼠肠黏膜屏障损伤过程中所起到的促进作用;研究Caspase-1抑制剂和大黄素对Caspase-1蛋白的表达及对其引发的炎症信号通路的抑制作用,对比疗效判断大黄素和Caspase-1抑制剂对肠道黏膜保护作用的靶点和机制是否一致,判断大黄素对肠粘膜的保护作用是否通过抑制Caspase-1蛋白表达来实现的,探索其分子机制,寻找新的治疗靶点,以期对SAP的精准治疗方案提供新的思路和途径。方法:80只SD大鼠被随机分成四组(每组20只):空白对照组(sham-operated group,SO)、重症急性胰腺炎组(severe acute pancreatitis group,SAP)、大黄素预处理组(emodin-treated group,EM)、caspase-1 抑制剂预处理组(ICE-I)。SAP 大鼠模型是通过3.5%的牛磺胆酸钠从十二指肠胰胆管入口处逆行灌入造模成功。作为干预剂的大黄素和caspase-1抑制剂分别在SAP造模前30分钟预先给药。在造模后24小时处死大鼠后取材检验:通过Elisa法测定各分组大鼠血清中IL-1β、IL-18含量差异;通过改良鲎试剂凝胶基质显色法检测各组实验大鼠血清内毒素含量的差异;光学显微镜和透射电子显微镜观察胰腺和小肠粘膜病理结构和细胞内线粒体等细胞器超微结构的改变;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测各组大鼠末端回肠粘膜凋亡细胞的数量;并通过荧光定量PCR、western blot和免疫组化法等方法测定各实验组大鼠肠粘膜中caspase-1的mRNA和蛋白表达差异。结果:造模后24小时内,单纯SAP造模组中8只大鼠死亡(生存率60%),大黄干预组有2只大鼠死亡(生存率90%),ICE-I干预组内3只大鼠死亡(生存率85%),而假手术组无大鼠死亡(生存率100%)。造模成功后24小时,发现SAP组大鼠相对于SO组大鼠,可以检测出明显升高的血清IL-1β和IL-18水平,光学显微镜下显示胰腺和肠粘膜组织炎症细胞浸润,出血、坏死程度明显加重,组织学评分明显增高,有统计学意义(p0.05),透射电镜下SAP大鼠肠粘膜细胞间隙模糊,细胞间连接消失,细胞内包括线粒体在内的细胞器肿胀。caspase-1的mRNA和蛋白表达水平较SO组明显升高,有统计学意义(P0.05),末端回肠粘膜组织粘膜层及固有层细胞凋亡明显增多,呈凋亡过度状况。而相对于SAP组大鼠,通过造模前caspase-1抑制剂和大黄素干预的大鼠实验组(ICE-I组和EM组),无论从血清IL-1β、IL-18含量,胰腺和肠粘膜组织病理学评分,还是肠粘膜组织中caspase-1的mRNA和蛋白表达水平都明显降低,有统计学意义(P0.05)。末端回肠粘膜细胞凋亡明显减少,透射电镜下回肠粘膜细胞间的细胞连接和胞内细胞器肿胀损害程度明显减轻。ICE-I组和EM组相比较,以上观察和检测指标对比差异不大,无统计学意义(P0.05)。结论:等同于caspase-1抑制剂,大黄素通过抑制肠粘膜细胞caspase-1的蛋白表达,并进一步抑制其炎症信号通道下游的包括IL-1β和IL-18在内的众多炎症因子和炎症介质的激活和释放,能明显减轻胰腺炎的严重程度和对肠粘膜屏障造成的继发性损害,减轻由此引发的肠内细菌和内毒素易位入血对急性胰腺炎大鼠造成的“二次打击”。在一定程度上减轻了急性胰腺炎合并周身多脏器功能衰竭的危重程度和发病范围,为重症急性胰腺炎精准治疗寻找新的治疗靶点和路径做了有益的探索。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R576
【部分图文】：

胰腺,腹水,胃肠道,大鼠

．组的生存率无明显差异。逡逑造模成功２４小时后处死大鼠，逐层开腹：假手术组（ＳＯ组）未见到腹水、逡逑胰腺坏死、皂化及胃肠道胀气（见附图２）。单纯ＳＡＰ组大鼠可见腹腔大量淡红逡逑色或淡黄色，呈恶臭味道的腹水存在，胃肠道呈明显胀气状态，在胃后胰腺区可逡逑见胰腺肿胀，大片状出血坏死，部分区域胰腺表面及周围系膜区可见有积脓和皂逡逑化斑等存在，而ＥＭ组和ＩＣＥ－Ｉ组可见有少量淡红色，轻度臭味的腹水存在，胃逡逑肠胀气较ＳＡＰ组减轻（见附图３，邋４）。逡逑３．２胰腺及末端回肠组织病理切片ＨＥ染色及病理学评分逡逑各组大鼠胰腺的组织病理学结果显示，ＳＯ组的大鼠胰腺结构无明显病理改逡逑变。相比之下，ＳＡＰ造模组的大鼠胲腺则出现广泛出血、坏死及炎症细胞大量浸逡逑．逦润，并伴有严重水肿，胰腺小叶明显分离。ＥＭ组与ＩＣＥ－Ｉ组的组织病理学改变逡逑较ＳＡＰ造模组有明显好转

粘膜组织,浆膜层,炎症细胞,粘膜下层

甚至脱落，并可见固有层、粘膜下层及浆膜层出现坏死，伴炎症细胞逡逑弥漫浸润。ＥＭ组与ＩＣＥ－Ｉ组的末端回肠组织损伤情况较ＳＡＰ造模组有明显好转，逡逑粘膜破损程度减轻，绒毛相对整齐，坏死灶减少，散在炎症细胞浸润（见图１）。逡逑２６逡逑

重症急性胰腺炎,血清,胰腺,组织病理学

见胰腺肿胀，大片状出血坏死，部分区域胰腺表面及周围系膜区可见有积脓和皂逡逑化斑等存在，而ＥＭ组和ＩＣＥ－Ｉ组可见有少量淡红色，轻度臭味的腹水存在，胃逡逑肠胀气较ＳＡＰ组减轻（见附图３，邋４）。逡逑３．２胰腺及末端回肠组织病理切片ＨＥ染色及病理学评分逡逑各组大鼠胰腺的组织病理学结果显示，ＳＯ组的大鼠胰腺结构无明显病理改逡逑变。相比之下，ＳＡＰ造模组的大鼠胲腺则出现广泛出血、坏死及炎症细胞大量浸逡逑．逦润，并伴有严重水肿，胰腺小叶明显分离。ＥＭ组与ＩＣＥ－Ｉ组的组织病理学改变逡逑较ＳＡＰ造模组有明显好转，出血、坏死程度减轻，局部有部分炎症细胞浸润，伴逡逑轻度水肿。逡逑末端回肠的组织病理学结果提示：ＳＯ组的大鼠回肠粘膜结构完整，绒毛排列逡逑整齐。ＳＡＰ模型组回肠粘膜出现明显的病理改变，包括回肠粘膜结构破损，绒毛逡逑排列紊乱，甚至脱落，并可见固有层、粘膜下层及浆膜层出现坏死，伴炎症细胞逡逑弥漫浸润。ＥＭ组与ＩＣＥ－Ｉ组的末端回肠组织损伤情况较ＳＡＰ造模组有明显好转

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