miR-214通过抑制HIF1AN的表达促进肝星状细胞的活化和迁移

发布时间：2020-09-11 23:22

　　 研究背景与目的 肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化必经的病理改变。肝星状细胞(hepaticstellate cell, HSC)的活化是肝纤维化发生、发展的中心环节，也是胶原蛋白沉积的关键因素。microRNA是在真核生物中发现的一类具有调控功能的内源性的非编码小分子RNA，在转录水平或转录后水平发挥调节作用。研究表明microRNA是慢性肝脏疾病进展过程中的重要调节因子。已有大量国内外文章报道miR-214在多种细胞内发挥着重要生物学调节作用，包括细胞增殖、凋亡、分化、脂肪代谢等。既往芯片数据显示miR-214在大鼠肝星状细胞活化过程中显著升高，本论文研究目的旨在研究miR-214在肝星状细胞活化过程中的调节作用，为肝纤维化的早期干预提供新的思路。 本研究通过应用实时定量PCR技术，对肝星状细胞活化过程(静息状态—活化状态)、DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0—S4期)、乙肝（HBV）相关肝纤维化病人各期肝组织(F0—F4期)以及TGF-β刺激前后的肝星状细胞进行miR-214表达水平检测，证实miR-214在肝星状细胞活化过程、DMN诱导大鼠肝纤维化模型、HBV相关肝纤维化病人肝组织标本以及TGF-β刺激后的肝星状细胞中显著升高，并与肝纤维化严重程度呈正相关。通过构建miR-214过表达及knockdown慢病毒载体，研究miR-214对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡、迁移和活化功能的影响，并探讨可能的机制。研究共分三个部分：（1）肝星状细胞活化过程、DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织、乙型病毒肝炎（HBV）相关肝纤维化病人各期肝组织以及TGF-β刺激前后的肝星状细胞进行miR-214表达水平检测；（2）miR-214慢病毒载体（过表达及knockdown）对肝星状细胞增殖、迁移与活化功能的影响；（3）miR-214靶基因的验证。 一、miR-214与肝星状细胞的活化密切相关 目的：检测miR-214在不同状态肝星状细胞以及各期肝纤维化组织中的表达水平，了解miR-214与肝星状细胞活化以及肝纤维化进程的相关性。 方法：分离培养原代肝星状细胞，收集24例不同分期的肝纤维化病人肝穿标本，并构建DMN诱导的肝纤维化动物模型，通过实时定量PCR技术检测肝星状细胞活化过程、DMN模型肝纤维化S0—S4期、乙肝相关肝纤维化病人各期肝组织(F0—F4期)以及TGF-β刺激前后的肝星状细胞中miR-214的表达水平。 结果：成功分离、鉴定、培养原代肝星状细胞，根据形态学特征及活化标志物的表达，将HSC2d作为静息状态HSC，14d作为完全活化状态HSC；构建大鼠肝纤维化模型，根据肝组织病理结果，DMN给药第一到第四周分别对应肝纤维化S1-S4期。抽提细胞、组织RNA，采用实时定量PCR方法证实：miR-214在肝星状细胞活化过程、DMN诱导大鼠肝纤维化模型、HBV相关肝纤维化病人肝组织标本以及TGF-β刺激后的肝星状细胞中显著升高，并与肝纤维化严重程度呈正相关。miR-214在HSC活化过程中表达显著升高达26倍(P0.01);以S0期肝组织作为对照组，S1-S4期组织中miR-214水平分别为对照组1.8倍、2.2倍、4倍、7.8倍(P0.05);以F0期肝组织作为对照组，F1-F4期组织中miR-214水平分别为对照组5倍、9倍、6倍、7倍(P0.01); TGF-β刺激后miR-214表达明显升高达刺激前7倍(P0.05). 二、 miR-214促进肝星状细胞的迁移与活化 目的：研究miR-214在细胞分子水平对大鼠肝星状细胞增殖、迁移和活化功能的影响。 方法：构建miR-214过表达及knockdown慢病毒；以不同MOI值(MOI取10到30)感染HSC-T6，应用荧光显微镜及实时定量PCR技术评估其感染效率；应用CCK-8检测细胞增殖，Transwell方法检测细胞迁移，real-time PCR、Western Blot方法检测肝星状细胞活化标志物Type I collagen与α-SMA mRNA与蛋白水平的表达。 结果：成功构建miR-214过表达及knockdown慢病毒载体，MOI值=30时，慢病毒感染HSC-T6的效率达90%以上，real-time PCR检测miR-214过表达慢病毒感染HSC-T6后miR-214的表达量增加3倍(P0.01)；与阴性病毒感染组（mock）相比，miR-214能显著促进肝星状细胞的迁移与活化，但是对细胞增殖无明显影响。 三、miR-214靶基因的验证 目的：探索miR-214在肝星状细胞中发挥生物学作用的可能机制。 方法：采用生物信息学技术筛选相关靶基因，通过荧光质粒报告系统对靶基因HIF1AN进行验证；采用实时定量PCR、Western Blot检测miR-214过表达及knockdown组、肝星状细胞活化过程（静息状态-活化状态）中、TGF-β刺激前后以及乙型病毒肝炎（HBV）相关肝纤维化病人各期肝组织中HIF1AN的表达。 结果：荧光质粒报告系统显示：miR-214可以显著抑制携有HIF1AN3’UTR的载体的荧光素酶活性达40%(P0.001)；与阴性病毒感染组相比，miR-214过表达显著降低HIF1AN mRNA和蛋白的表达量(P0.01)，miR-214knockdown显著增加HIF1ANmRNA和蛋白的表达量(P0.05)；与静息状态（2d）肝星状细胞相比，HIF1AN在活化状态（14d）肝星状细胞中表达下降50%(P0.001)；与TGF-β刺激前相比，TGF-β刺激后HIF1AN表达量下降35%(P0.01)；与F0期病人肝组织相比，HIF1AN表达量与肝纤维化程度呈反比(P0.05)。 四、统计学分析 数据用均数±标准差表示，数据由SPSS16.0软件统计包处理。多组间的比较用One-Way ANOVA方差分析。P0.05认为有统计学差异。 结论 一、miR-214在肝星状细胞活化过程、DMN诱导大鼠肝纤维化模型、HBV相关肝纤维化病人肝组织标本以及TGF-β刺激后的肝星状细胞中显著升高，并与肝纤维化严重程度呈正相关。 二、肝星状细胞中miR-214显著促进肝星状细胞的活化、迁移，但是对增殖并无影响。 三、细胞、组织水平证实HIF1AN表达水平与miR-214呈负相关，进而推测miR-214对肝星状细胞生物学活性的调节可能是通过下调HIF1AN的表达实现的。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

QRT-PCR检测肝纤维化模型各期肝组织中mi注：与S0期肝组织相比，*P<0.05，差异有统计V 相关肝纤维化病人各期肝组织中 m,4)共24例HBV相关肝纤维化病人的肝穿标本HBV感染但无肝纤维化的病人标本作为对照组PCR技术进行miR-214水平的检测，应用PCmiR-214的表达。结果显示：miR-214在肝纤维织作为对照组，F1-F4期组织中miR-214水平分01)。

PCR检测HBV相关肝纤维化病人各期肝组织中miR注：与F0期肝组织相比，**P<0.01，差异有统计学意F-β刺激前后 HSC-T6 中 miR-214 的差l)加入大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)并孵育24h后抽提肝星状细胞miR-214水平的检测，应用real-time PC肝星状细胞中miR-214表达。结果显示：TGF-β刺激7倍(P<0.05)。

R检测HBV相关肝纤维化病人各期肝组织中注：与F0期肝组织相比，**P<0.01，差异有统-β刺激前后 HSC-T6 中 miR-214入大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)并孵育24h后星状细胞miR-214水平的检测，应用real-tim星状细胞中miR-214表达。结果显示：TGF(P<0.05)。

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 乔俏;周泓旭;李光;;HIF-1α对非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡作用机制的探讨[J];中华肿瘤防治杂志;2011年07期

本文编号：2817313