下调ubc9对人肝星状细胞增殖的影响及其机制研究

发布时间：2020-09-12 12:56

　　 背景： 肝纤维化（hepatic fibrosis, HF）是肝脏对不同病因所致的慢性肝脏疾病的病理学综合征,是各种慢性肝病发展的必经阶段。在整个肝纤维化的发生发展过程中，肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）的激活是一个关键环节。活化的HSCs能过量表达α-平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA）并合成异常增多的细胞外基质（Extracellular Cell Matrix，ECM）超过肝脏的代谢能力从而导致其在肝内大量聚集。HSCs活化的初始阶段主要是由邻近细胞(如肝细胞、Kupffer细胞等)通过旁分泌作用启动的。此外，HSCs还可分泌一些细胞因子促进Kupffer细胞激活以及通过自分泌或者旁分泌促进自身进一步激活。 小泛素样分子相关修饰物（small ubiquitin-like modifier, SUMO）是一种类泛素样蛋白，与泛素(ubiquitin)泛素介导的蛋白降解途径不同，SUMO化的结果并不是将靶蛋白降解，而是通过修饰来增强它们的稳定性或者调节其亚细胞定位及影响其转录活性，从而发挥更加广泛的作用。我们前期的研究发现随着肝纤维化的进展，SUMO-1的表达量逐渐增加。SUMO-1可能通过增强TGF-β1及PDGF的表达，进而促进HSC的增殖和活化，促进其分泌胶原，表现出促肝纤维化作用。SUMO化修饰过程需要多种酶参与，但只有唯一的接合酶-ubc9。因此，我们推断ubc9可能通过调节SUMO化参与肝纤维化甚至肝癌的发生发展。为进一步研究ubc9在肝纤维化过程中的作用及其机制，本实验首先利用RT-PCR和Western blot检测正常肝细胞株L02、人源性肝星状细胞株LX-2和肝癌细胞HepG2、SMMC-7721内ubc9的表达量。再将pcDNA6.2-mir ubc9瞬时转染LX-2，以Western blot方法检测转染前后LX-2细胞内ubc9、α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2等基因的表达情况，以ELISA分析转染前后LX-2细胞分泌TNF-α与IL-6的变化，以流式细胞术分析转染前后LX-2细胞凋亡与周期的变化情况。以期阐明ubc9在肝纤维化中的作用机制。 目的： 探讨ubc9在LX-2细胞活化与增殖过程中的作用及其机制 方法： 分别在体外培养正常肝细胞株L02、肝星状细胞株LX-2和肝癌细胞HepG2、SMMC-7721后提取RNA及蛋白质，再利用RT-PCR及western blot检测ubc9的表达水平；将人工合成的针对ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9质粒转染LX-2，采用RT-PCR及western blot方法检测转染后LX-2中ubc9的表达变化，以westernblot方法检测转染后LX-2中α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2的表达变化，以ELISA分析转染前后LX-2细胞分泌TNF-α与IL-6的变化，以流式方法检测各实验组LX-2细胞的周期及凋亡。 结果： RT-PCR与Western blot检测发现正常肝细胞、肝星状细胞和肝癌细胞内均会表达ubc9基因；人工合成的针对ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9质粒能抑制LX-2细胞中ubc9、α-SMA、p65及Bcl-2基因的表达，同时能增加IKBα的表达，与对照组相比差异具有统计学意义（P 0.05）。转染后LX-2的周期被阻滞在G2/M期，并且能够促进LX-2的凋亡，与对照组相比差异具有统计学意义（P0.05）。以上结果说明，下调ubc9能够抑制LX-2的增殖。 结论： 1. ubc9可能通过调节Bcl-2的表达而参与肝星状细胞的凋亡过程； 2. ubc9可能通过作用于IKBα及p65调控NF-κB信号通路从而参与肝纤维化的过程。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

图 5 各组细胞中 ubc9 mRNA 的表达量Fig.5 Expression of ubc9 mRNA in each group; b The bargraph represents the mean± standard deviation of thp.A: L02 group; B:LX-2 group; C:HepG2 group; D: SMMC7 mRNAexpression of ubc9 in cells of each group (RGS,xA B C 0.31±0.03 0.58±0.04 0.77±0.07 GS, relative gray scales.X-2 group; C:HepG2 group; D:SMMC-7721 group. blot 检测分析 LX-2 细胞内 ubc9 的表达水平2、HepG2、SMMC-7721 细胞内均会表达 ubc9 蛋白

第 3 章 实验结果 5 Protein expression of ubc9 in cells of each group (RGS,xA B C 0.42±0.06 0.77±0.07 0.89±0.08 GS, relative gray scales. LX-2 group; C: HepG2 group; D: SMMC-7721 group. 检测分析 mir ubc9 沉默 ubc9 的效果相比，人工合成的针对 ubc9 基因的 miRNA 质粒能X2 中 ubc9 基因的表达，差异具有统计学意义（0.3 与 Table 6）

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 肖志华;郭武华;张吉翔;;SUMO-1在实验性大鼠肝纤维化形成过程中的作用[J];世界华人消化杂志;2010年14期

2 郭武华;袁丽华;肖志华;张吉翔;;SUMO-1基因在肝癌中的表达及意义[J];重庆医学;2009年24期

3 赵珍东;黄兆胜;;姜黄素对HSC PDGF-BB、PDGFRβ及ERK_1表达的影响[J];中药材;2009年05期

本文编号：2817656