熊果酸对大鼠肝星状细胞内活性氧的影响及诱导肝星状细胞凋亡机制的研究

发布时间：2020-09-14 14:31

　　 研究背景:肝纤维化是肝硬化的前期病理阶段,是肝脏受到慢性损伤时,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)可逆性沉积的创伤愈合过程。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化形成过程中发挥关键作用,是肝纤维化时ECM的主要来源细胞,因此促进活化HSC的凋亡成为阻断肝纤维化的重要策略。我们的前期研究结果表明熊果酸在体外可以较明显的抑制HSC细胞的增殖、诱导HSC细胞的凋亡,当熊果酸浓度小于75μM时对L02肝细胞的生长抑制率为负值,将熊果酸作用于二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化实验大鼠后,能够明显改善肝纤维化大鼠肝功能,明显减轻肝细胞坏死和降低肝脏组织胶原纤维增生程度,同时其能阻断大鼠肝纤维化形成过程中肝脏氧化应激和脂质过氧化。本研究将在前期研究结果的基础上观察HSC内活性氧参与调控肝星状细胞凋亡的途径,进一步探讨熊果酸诱导其凋亡的可能作用机制,从而为肝纤维化治疗提供新的治疗方案。 目的:通过观察HSC-T6在瘦素、熊果酸、NAC等药物作用后,HSC-T6内ROS水平、NF-κB活性、XIAPmRNA表达及凋亡率的变化,来探讨HSC-T6内活性氧参与调控肝星状细胞凋亡的途径及熊果酸诱导其凋亡的可能作用机制。 方法:取对数生长期的肝星状细胞(HSC-T6)进行随机分组:瘦素刺激组(100 ng/ml),熊果酸(50μM)预处理组,NAC(10mM)预处理组和空白对照组。熊果酸及NAC预处理组,分别用熊果酸、NAC预处理HSC30min后加入瘦素刺激。药物作用HSC1h,12h,24h,采用流式细胞术检测细胞内DCF的荧光强度以观察HSC内ROS的水平;药物作用2h后采用免疫细胞化学术检测HCS-T6中NF-κB(P65)核移位率;12h、24h后RT-PCR方法检测XIAP mRNA的表达;48h采用流式细胞术HSC-T6凋亡率的变化。 结果:1.瘦素刺激组细胞内DCF荧光强度较空白对照组显著增高(P0.001);瘦素刺激组HSC-T6细胞24h时细胞内DCF荧光强度要高于作用12h时(P0.05);熊果酸预处理组、NAC预处理组细胞内DCF荧光强度均低于同时间点瘦素刺激组(P0.001);熊果酸预处理组1、12、24小时细胞内DCF荧光强度逐渐降低。 2.免疫细胞化学分析发现,瘦素刺激组中将瘦素作用于HSC-T6细胞2小时后NF-κB出现明显核移位现象,与空白对照组相比差异有统计学意义(P0.001);用熊果酸、NAC预处理HSC-T6细胞半小时后,再用瘦素刺激,发现前两者NF-κB核移位率均显著低于瘦素刺激组(P0.001),而它们两者间NF-κB核移位率比较差异无统计学意义(P0.05)。 3.瘦素刺激组中HSC-T6经瘦素刺激后其XIAP mRNA表达在24h时显著高于空白对照组(P0.01);HSC-T6经过熊果酸、NAC预处理后XIAP mRNA的表达在12h均低于瘦素刺激组与空白对照组(P0.01~0.05),而两预处理组XIAP mRNA的表达在12h差异无统计学意义(P0.05);熊果酸预处理组XIAP mRNA的表达在24h要低于瘦素刺激组、空白对照组与NAC预处理组(P0.01);不同时间点:空白对照组、NAC预处理组XIAP mRNA的表达在12h、24h无显著差异(P0.05);瘦素组XIAP mRNA的表达在24h时要高于12h(P0.01);熊果酸预处理组XIAP mRNA的表达在24h低于12h(P0.05)。 4.瘦素刺激组中HSC-T6细胞经瘦素刺激48h后其凋亡率低于空白对照组(P0.05);熊果酸预处理组、NAC预处理组HSC-T6 48h凋亡率较瘦素组均有升高(P0.001、0.05),而熊果酸预处理组HSC-T6 48h凋亡率高于NAC预处组与空白对照组(P0.05)。 结论: 1.瘦素可以抑制HSC-T6细胞的凋亡,而HSC-T6细胞经熊果酸预处理后,凋亡率升高,表明熊果酸可诱导HSC凋亡。 2.瘦素刺激HSC-T6后可使细胞内ROS水平升高,而HSC-T6细胞经熊果酸预处理后,其内ROS水平降低,表明熊果酸可抑制由瘦素刺激导致的HSC-T6细胞内ROS水平的升高。 3.瘦素可以促进HSC-T6细胞内NF-κB活化及XIAPmRNA表达,而HSC-T6细胞经熊果酸预处理后,NF-κB活性及XIAPmRNA表达明显减弱,表明熊果酸可以抑制由瘦素刺激导致的细胞内NF-κB活化及XIAPmRNA表达。 4.推测减少HSC-T6细胞内ROS的产生、抑制NF-κB活化及XIAPmRNA的表达可能是熊果酸诱导HSC-T6细胞凋亡的机制之一。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

附图 1：1h 时流式细胞仪检查的 HSC-T6 细胞内 DCF 荧光强度结果A:瘦素组 D：空白对照组Marker % GatedAll 100.00M1 51.26M1CMarker % All 1M1 M1AMarker % GatedAll 100.00M1 95.04M1

附录附图 1：1h 时流式细胞仪检查的 HSC-T6 细胞内 DCF 荧光强度结果A:瘦素组 D：空白对照组AMarker % GatedAll 100.00M1 95.04M1MaM1

各组药物作用12h后流式细胞仪检查的HSC-T6细胞内DCF荧光强度结果

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 李博;何文华;刘戈云;朱萱;;活性氧簇与肝纤维化发病的研究进展[J];国际消化病杂志;2009年02期

2 戴颖;朱萱;;熊果酸抗实验性大鼠肝纤维化作用机制的研究[J];江西医药;2008年05期

本文编号：2818290