内质网应激蛋白和黏蛋白2在小鼠结肠炎中的表达及意义

发布时间：2020-09-14 15:12

　　背景:炎症性肠病(inflammation bowel disease,IBD)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)两种。近年来随着生活条件的改善和环境不断变化,该病在我国的患病人数呈明显增加趋势。炎症性肠病的病因和发病机制尚不明确,目前多认为该病的发生是由遗传、环境、微生物和免疫等多种因素相互作用所致。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞内负责蛋白质合成、折叠和分泌的重要细胞器,许多因素可以引起内质网稳态紊乱,如营养缺乏、氧化应激等,导致未折叠或错误折叠蛋白质在内质网腔堆积,引发内质网应激(ER stress,ERS)。当出现内质网应激时,机体将启动一系列适应性反应使细胞适应应激继续存活,这种反应称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。未折叠蛋白反应通过三种感受器蛋白发出一系列调节信号,通过限制蛋白质翻译减轻内质网负荷,帮助蛋白质正确折叠,加速错误折叠蛋白质降解,恢复内质网稳态。当内质网应激持续时间过长或反应程度过深将会引起细胞凋亡,导致组织细胞受损。肠道上皮细胞不断更新,属于高分泌细胞,对内质网应激尤其敏感。近年来研究发现内质网应激与多种疾病发生发展有关,由内质网应激诱导的未折叠蛋白反应多条通路与炎症反应通路相偶联。有人提出内质网应激参与炎症性肠病的发生与发展,但内质网应激对炎症性肠病的具体作用机制尚不明确。肠粘膜屏障损伤是溃疡性结肠炎发病的一个关键因素,大量黏蛋白构成的粘液层是肠粘膜重要的化学屏障,杯状细胞产生的黏蛋白(mucin,MUC)2是结肠粘液层主要的大分子结构,有研究表明MUC2表达异常与肠道疾病密切相关。本研究利用葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium,DSS)制造小鼠结肠炎模型,检测炎症状态下结肠组织的内质网应激蛋白和MUC2的表达情况,试图为进一步认识炎症性肠病的发病机制提供更多科学依据。目的:观察内质网应激蛋白GRP78、PERK、ATF6、IRE1βm RNA和蛋白,IRE1α、CHOP、XBP1u和XBP1s m RNA以及MUC2 m RNA和蛋白在不同浓度DSS诱导的结肠炎组织中的表达情况,探讨这些分子表达变化在炎症过程中的意义。方法:将8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为三组:正常对照组:正常自由饮水;1.5%DSS组和2.5%DSS组:分别自由饮用含1.5%(1.5g/100ml)和2.5%DSS的水溶液6天建立急性肠炎模型。每组10只。通过疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分、测量结肠长度、苏木素伊红(hematoxylin andeosin,HE)染色病理评分、检测炎性因子TNFα和IL-6 m RNA的表达水平来评估结肠炎症损伤程度。采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色法检测结肠组织中GRP78、IRE1β、ATF6、PERK和MUC2的蛋白表达水平;实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR)法检测GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、XBP1u、XBP1s、CHOP和MUC2的m RNA表达水平。结果:1.正常对照组无结肠炎表现,1.5%DSS组和2.5%DSS组分别呈轻度和重度结肠炎。炎性细胞因子TNFα和IL-6 m RNA在1.5%DSS组表达增加,在2.5%DSS组表达进一步增加(均P0.05)。2.免疫组化结果:GRP78、IRE1β、PERK、ATF6和MUC2蛋白在正常对照组均表达;IRE1β、PERK、ATF6和MUC2蛋白在1.5%DSS组表达减少(均P0.05);GRP78、IRE1β、PERK、ATF6和MUC2蛋白在2.5%DSS组表达均明显减少(均P0.05);IRE1β、PERK、ATF6和MUC2在2.5%DSS组与1.5%DSS组表达差别不明显。3.RT-PCR结果:GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、XBP1u、XBP1s、CHOP和MUC2 m RNA在正常对照组均表达;GRP78、CHOP m RNA在1.5%DSS组无变化,2.5%DSS组明显减少(均P0.05);XBP1u m RNA三组之间无差异;IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6和MUC2 m RNA在1.5%DSS组和2.5%DSS组表达均减少(均P0.05),2.5%DSS组与1.5%DSS组之间无差别。结论:1.内质网应激蛋白GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、CHOP、XBP1u及XBP1s在结肠正常结构及生理功能的维持中发挥作用2.炎症状态下GRP78、IRE1α、IRE1β、PERK、ATF6、CHOP和XBP1s表达均减少,这种减少导致的内质网应激和未折叠蛋白反应能力的下降在炎症过程中可能起到一定作用。3.MUC2表达减少导致的肠粘膜屏障损伤与肠道炎症的发生发展有关。
【学位单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R574.62
【部分图文】：

变化情况图,变化情况,小鼠,肛周

第 3 章结果第 3 章结果小鼠急性结肠炎造模结果.1 一般情况观察及 DAI 评分正常对照组小鼠造模期间进食饮水、精神状态、活动、大小便均正常，泽，体重逐日递增。1.5%DSS 组小鼠于造模第 5 天出现懒动、进食饮水7 天 5 只小鼠出现肉眼血便，并伴有稀便和肛周潮湿，同时出现体重下%DSS 组小鼠于造模第 4 天开始相继出现懒动、精神萎靡、毛发黯淡无光水减少，并出现稀便、肉眼血便、肛周潮湿现象，第 7 天 9 只小鼠肉眼，4 只体重下降超过 10%，但无小鼠死亡。1.5%DSS 组和 2.5%DSS 组和 DAI 评分与正常对照组相比均显著增高 (均 P<0.05) (图 3-1 和图 3-

小鼠,结肠,长度,血便

图 3-2 各组小鼠疾病活动指数 (DAI) 评分 (n=10/组)附注：a: P<0.05 vs 正常对照组；c: P<0.05 vs 1.5%DSS 组ig. 3-2 The scores of disease activity index of mice with different treatments (n=10/groNote: a: P<0.05 vs normal control; c: P<0.05 vs 1.5%DSS group2 结肠外观及长度测量正常对照组小鼠结肠肠壁光滑，肠腔内充满椭圆形粪便。1.5%DSS DSS 组小鼠结肠内均含不成形稀便及不同程度血便，结肠肠壁与对照组变薄。1.5%DSS 组和 2.5%DSS 组小鼠结肠长度均较正常对照组明显P<0.05)，2.5%DSS 组与 1.5%DSS 组相比缩短更加明显 (P<0.05) (表 3表 3-1 各组小鼠结肠长度Tab. 3-1 The colon length of mice with different treatments分组例数结肠长度 (cm)

小鼠,附注,检测结果

表 3-2 各组小鼠结肠组织学评分Tab. 3-2 The scores of histological index of mouse colon tissues分组例数组织学评分正常对照组 10 0.5±0.81.5%DSS 组 10 6±1.4a2.5%DSS 组 10 8.3±1.5ac附注：a: P<0.05 vs 正常对照组；c: P<0.05 vs 1.5%DSS 组Note: a: P<0.05 vs normal control; c: P<0.05 vs 1.5%DSS group4 炎性指标 TNFα、IL-6 mRNA 检测结果1.5%DSS 组和 2.5%DSS 组 TNFα mRNA 均较正常对照组明显升高.05)；与正常对照组相比，IL-6 mRNA 在 1.5%DSS 组和 2.5%DSS 组均 (均 P<0.05) (图 3-3)。

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