TRAF6基因沉默对内毒素炎症反应的抑制效应研究

发布时间：2020-09-15 16:42

　　第一部分内毒素刺激对TRAF6基因表达的影响目的：观察内毒素刺激对小鼠RAW264.7巨噬细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor-6, TRAF6)基因表达的影响,阐明内毒素刺激与TRAF6基因表达的关系。方法：RAW264.7细胞分为LPS组、地塞米松组、姜黄素组、实验对照组和正常对照组。LPS组以终浓度为100μg/L LPS刺激；地塞米松组以终浓度为0.5 mg/L地塞米松预处理8 h,姜黄素组以终浓度为20μmol/L姜黄素预处理8 h；实验对照组用含DMSO(浓度0.1%)的DMEM培养液培养,正常对照组作为实验对照不予以任何处理。LPS刺激2 h、4 h、8 h和16 h后,免疫细胞化学染色检测TRAF6蛋白表达,realtime-PCR检测TRAF6 mRNA表达；LPS刺激8 h时Western blot检测TRAF6蛋白,在mRNA水平和蛋白质水平检测内毒素刺激对TRAF6基因表达的影响。结果：小鼠RAW264.7细胞中TRAF6 mRNA的正常表达量相对较低,当LPS刺激4 h时,TRAF6 mRNA表达明显增加；随着时间延长其表达进一步增加,至16 h时,TRAF6 mRNA表达达到高峰。用地塞米松和姜黄素干预后,TRAF6 mRNA表达量均低于同一时间LPS组(P0.05),但始终高于正常水平。同一时间点地塞米松组与姜黄素组比较无明显差异(P0.05),实验对照组细胞TRAF6 mRNA表达水平较正常对照组无明显变化(P0.05)。Western blot检测TRAF6蛋白表达,结果与TRAF6 mRNA结果相似。结论：TRAF6 mRNA及TRAF6蛋白表达与LPS刺激有明确的时效关系。第二部分TRAF6 siRNA表达质粒的构建和筛选实验一TRAF6 siRNA表达质粒的构建与鉴定目的：构建针对小鼠TRAF6基因的短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体,为下一步的细胞转染奠定基础。方法：在NCBI的Nucleotide库中检索小鼠TRAF6 mRNA序列,应用Invitrogen公司的在线设计软件BLOCK-iTTM RNAi Designer,针对小鼠TRAF6 mRNA设计筛选4条siRNA序列。体外合成编码短发夹RNA序列的DNA寡核苷酸单链,经退火成互补双链,将相应的双链DNA被插入pGCsi-U6/GFP/Hygro质粒中,构建重组质粒pGCsi-TRAF6-shRNA1、2、3、4。将重组质粒转化进E.coli DH5a,最后以PCR法分析鉴定阳性重组质粒并进行DNA测序。在紫外分光光度计上OD260和OD280读取吸光度值,检测质粒DNA的浓度。结果：siRNA寡核苷酸单链成功退火,合成双链DNA模板,凝胶电泳可见,59 bpMark处呈现清晰条带。靶向TRAF6 mRNA的4种重组质粒载体pGCsi-TRAF6-shRNA,经酶切和DNA测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,证实重组质粒载体构建成功。4种重组质粒DNA OD260/OD280比值均在1.8～2.0之间,质粒DNA质量良好,符合实验要求,为下一步体外、体内实验奠定了基础。结论：靶向TRAF6基因的重组质粒载体pGCsi-TRAF6-shRNA构建成功,为研究TRAF6对内毒素炎症反应的调控作用奠定基础。实验二TRAF6基因沉默优化序列的筛选和确认目的：将TRAF6基因特异性重组质粒载体pGCsi-TRAF6-shRNA转染RAW 264.7细胞,检测TRAF6基因在mRNA和蛋白质水平的表达情况,体外筛选干扰小鼠RAW264.7细胞TRAF6基因的最佳重组质粒载体pGCsi-TRAF6-shRNA。方法：使用不同比例的DNA质粒／脂质体复合物,将重组质粒转染至RAW 264.7细胞,荧光显微镜观察转染效果。重组质粒转染细胞48 h后,应用MTT法检测转染重组质粒pGCsi-TRAF6-shRNA后细胞活性的变化,realtime-PCR和Western blot检测转染细胞TRAF6基因的mRNA和蛋白质表达,体外筛选出对TRAF6基因表达具有最佳抑制效果的重组质粒。结果：荧光显微镜分析转染效率显示,DNA(g)/Trans Fectin(L)为2：5时重组质粒转染效率最高。MTT检测结果显示,重组质粒pGCsi-TRAF6-shRNA1、2能显著抑制RAW264.7细胞的增殖活性,与正常对照组相比有显著差异(P0.01)。realtime-PCR结果显示,pGCsi-TRAF6-shRNA1、2组细胞TRAF6 mRNA表达水平显著降低。其中,pGCsi-TRAF6-shRNA 1对RAW264.7细胞TRAF6基因表达的抑制作用最为显著,抑制率为65.25%,与正常对照组相比具有明显差异(P0.05)。Western blot检测结果显示,pGCsi-TRAF6-shRNA1对靶基因蛋白表达抑制作用最明显,TRAF6基因蛋白表达抑制率为60.07%,与正常对照组相比差异显著(P0.05)。结论：pGCsi-TRAF6-shRNA1真核表达载体可在体外高效地抑制TTRAF6基因表达,为进一步研究TRAF6基因沉默对内毒素炎症反应的影响奠定基础。第三部分TRAF6 siRNA对RAW264.7细胞内毒素炎症的影响目的体外研究TRAF6沉默基因对RAW 264.7细胞内毒素炎症反应的影响。方法实验分为5组：(A)pTRAF6-shRNA1(即pGCsi-TRAF6-shRNA1)组,质粒pTRAF6-shRNA1+LPS; (B)阳性对照组,姜黄素(20μmol/L)+LPS; (C)阴性对照组,空白质粒±LPS；(D)空白对照组,仅予100μg/L LPS刺激；(E)正常对照组,正常培养不予任何处理。LPS刺激后0 h、4 h、8 h和16 h,收集细胞上清,ELISA法测定上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1。LPS刺激24 h后,收集细胞,realtime PCR方法检测TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA, Western blot检测细胞核内NF-κB p65蛋白表达。结果100μg/L LPS刺激各组RAW264.7细胞后,细胞上清液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1表达量都明显增加,与正常对照组相比差异显著(P0.01),其中TNF-α、IL-1β在8 h内达高峰,TGF-β1在16 h达高峰,说明LPS刺激可引起细胞TNF-α、IL-1β、TGF-β1分泌。将pTRAF6-shRNA1转染RAW264.7细胞后,TNF-α、IL-1β、TGF-β1增长率均明显低于阴性对照组和空白对照组(P0.01)。Realtime PCR检测结果显示,pTRAF6-shRNA1组IL-6、COX-2 mRNA表达明显下调,与正常对照组比较有显著差异。Western blot结果表明,pTRAF6-shRNA1组细胞核内NF-κB p65蛋白表达明显减少。结论重组质粒pTRAF6-shRNA可能通过抑制LPS诱导的NF-κB p65核转位,降低相关炎症细胞因子和介质的分泌,抑制RAW264.7细胞内毒素炎症反应。第四部分TRAF6siRNA对急性肝衰竭内毒素炎症小鼠的保护作用实验一不同转染方式对GFP表达质粒在小鼠肝脏的表达影响目的：研究经流体力学注射、门静脉和腹腔常规注射3种不同途径注射GFP表达质粒后,目的基因在小鼠肝脏的表达情况及其转基因效率。方法：将裸质粒或脂质体包裹的质粒DNA分别应用流体力学注射、门静脉及腹腔常规注射法注入同种异体小鼠体内,48 h后分别取血和肝组织,常规生化方法检测血清谷丙转氨酶(ALT)和总胆红素(TB),HE染色检测肝组织病理变化,新鲜组织冰冻切片观察3种转染途径对质粒DNA在小鼠肝脏的表达影响。结果：注射48 h后,腹腔常规注射组与正常组比较,ALT和TB的升高幅度较小,与流体力学注射组比较该差异无统计学意义(P0.05),且各组内脂质体复合物组与裸质粒组比较差异无统计学意义(P0.05)。常规石蜡切片HE染色显示,HI组及PV组小鼠肝细胞轻度水肿,各组内裸质粒组和脂质体复合物组之间无明显差异。流体力学注射组及门静脉常规注射组均可见大量绿色荧光蛋白表达,两组的荧光表达量差异无统计学意义(P0.05),腹腔注射组小鼠的肝脏仅见少量的绿色荧光表达,但三组内脂质体／质粒DNA复合物组绿色荧光表达量均明显高于裸质粒组(P0.05)。结论：应用流体力学注射及门静脉常规注射脂质体／质粒DNA复合物途径,目的基因均在小鼠肝脏高效表达,两种途径无明显差异,流体力学注射可广泛用于肝靶向性的活体基因转染。实验二TRAF6siRNA对急性肝衰竭内毒素炎症小鼠的保护作用目的：研究TRAF6沉默基因对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭内毒素炎症小鼠的作用及其可能的机制。方法：BALB/c小鼠随机分为正常对照组、急性肝衰竭(ALF)模型组、阳性对照(姜黄素)组、阴性对照(空白质粒)组和RNAi(pTRAF6-shRNA1)组。采用流体力学注射法将pTRAF6-shRNA1表达质粒转染小鼠,24 h后重复注射一次。第二次注射后24 h,予LPS(20μg/kg)联合D-氨基半乳糖(D-GalN,600 mg/kg)制做急性肝衰竭内毒素炎症模型。观察小鼠存活率,并于造模后16 h,采用常规生化方法血清ALT、AST,免疫组化染色检测iNOS和NF-κB p65在肝细胞的表达；Realtime-PCR检测TRAF6、IL-6、COX-2及NF-κB p65 mRNA的表达；Western blot检测总蛋白和细胞核内NF-κB p65的表达；造模后4、8、16 h,ELISA检测血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平变化。结果：荧光显微镜观察显示真核表达质粒pTRAF6-shRNA1成功转染进入小鼠肝组织。pTRAF6-shRNA1可明显抑制小鼠肝组织TRAF6 mRNA和TRAF6蛋白表达(P0.01),其中TRAF6 mRNA表达抑制率为60.13%, TRAF6蛋白抑制率为52.08%,与正常小鼠比较均有显著性差异(P0.01)。LPS/D-GalN腹腔注射16 h后,小鼠血清ALT、AST水平及肝组织病理学检测显示造模成功。RNAi (pTRAF6-shRNA1)组小鼠72h的存活率为49.3%,高于其它组(姜黄素组为36.2%). pTRAF6-shRNA1可明显降低小鼠血清ALT和AST水平,与ALF模型组比较有显著意义(P0.01)。Realtime-PCR结果显示RNAi组小鼠IL-6、COX-2及NF-κB p65 mRNA表达下降,与ALF模型组比较有显著意义(P0.01)。ELISA检测显示RNAi组小鼠血浆TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平上调,但始终明显低于同时间点ALF模型组,TNF-α、IL-1p于8 h达到峰值,TGF-β1于16 h达到峰值。免疫组化染色显示RNAi组iNOS蛋白表达较ALF模型组降低。姜黄素组与RNAi组比较无显著差异(P0.05),姜黄素有降低转氨酶,对阻止TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2及iNOS升高有一定作用。Western blot技术显示ALF模型组小鼠肝组织中总蛋白和胞核NF-κB p65表达均增加；pTRAF6-shRNA1组小鼠肝组织总蛋白NF-κB p65表达水平显著高于正常组小鼠总蛋白NF-κB p65水平(P0.01),但较ALF模型组比较无明显变化(P0.05),胞核NF-κB p65明显降低,与ALF模型组比较有显著性差异(P0.05)。结果提示TRAF6基因沉默,不仅能降低细胞NF-κB p65表达水平,还能明显抑制NF-κB p65核转位。结论：pTRAF6-shRNA1可能通过下调NF-κB p65水平,抑制炎症相关细胞因子和炎性介质表达水平,从而减轻内毒素／半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R575.3
【部分图文】：

急性肝衰竭,信号传导通路,激酶,丝裂素活化蛋白激酶

图1LPS/TLR4介导的信号传导通路治疗急性肝衰竭过度炎症反应的研究重点。死因子受体相关因子一6[翎F(tumourneerosisfaetor)一rec即tRAF6』作为介导NF一KB信号转导的一个关键衔接蛋白，在TL侧中的发挥重要调节作用[8，9]。TRAF6既可激活NF一沼诱导inase，NIK)，同时，又可激活丝裂素活化蛋白激酶/ERK激酶激proteinkinase/ERKkinasekinasel，MEKKI)，是髓样分化因子ionracto:58，MyD8s)依赖性信号转导途径主要蛋白分子(见图TRAF6缺失小鼠明显降低LPs诱导的NF一沼和诱生型No合成一1和IL一18信号传导障碍，机体对LPS低反应。他们还发现TR能完全阻止LPS诱导的JNK活化。Katie等也发现TRAF6基s诱导的e一Jun氨基末端激酶(c一Junamino一terminalkinase，JNK)

细胞存活率,细胞活力,姜黄素,形态发生

接种RAW264.7细胞4h后细胞贴壁。第3天，倒置显微镜下观察，可见多数细胞有明显“伪足”伸出，大小不一，主要为圆形、椭圆形或梭形，细胞生长较快，按l:3传代第3天汇合率达90%以上(见图1一l)。细胞活力和活性均在90%以上。图1一1传代第3天的RAW264.7细胞 (X200)2各组细胞活力检测结果LpS刺激后，RAW264.7活化，形态发生改变(图l一3)。LPs刺激后Zh、4h、sh和16h，MTT掺入法检测各组细胞存活率，结果显示:LPS组和姜黄素(Cur)组细胞存活率略有增加，地塞米松(DM)组细胞存活率略有减少，但比较各组细胞存活率无统计学差异(几0.05)(图l一2)。 hhhaaa.，‘吸.叻

时间曲线,细胞存活率,时间曲线,细胞活力

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