恩替卡韦联合GM-CSF治疗慢乙肝患者NK细胞亚群及其代谢活性研究

发布时间：2020-09-17 09:18

　　慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是指持续感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)超过6个月所引起的慢性肝脏炎症性疾病。乙肝病毒的持续性感染是慢性乙肝疾病进展的主要原因,但HBV感染并不会直接造成肝脏损伤,肝脏的炎症性损伤是机体免疫系统清除HBV过程中形成的。HBV进入肝细胞后,利用自身聚合酶将半环状的病毒基因组以负链为模板进行复制,形成闭合环状的DNA(convalent close circular DNA,cccDNA),然后以cccDNA为模板进行基因组的转录和翻译,不断形成新的病毒颗粒。cccDNA常与肝细胞中的核小体结合形成微染色体,抗病毒药物治疗难以将其彻底清除,cccDNA池是HBV持续感染的关键,只有彻底清除肝细胞中的cccDNA才能实现CHB临床治愈。免疫调节被认为最有前景清除cccDNA的方式。自然杀伤细胞(natural killer cells,NK细胞)是天然免疫系统的重要组成部分,在机体抗病毒感染过程中发挥重要作用。研究表明,NK细胞在HBV慢性持续性感染过程中的表型和功能不同于急性感染,提示NK细胞可能在机体清除cccDNA过程中发挥作用。对CHB患者治疗过程中NK细胞表型和功能的研究,有助于进一步了解NK细胞在HBV慢性感染的作用,为临床抗病毒疗效的判断和生物免疫治疗提供思路,最大限度的长期抑制HBV DNA的复制,减轻肝细胞炎性坏死以及肝纤维化,延缓和减少肝功能衰竭、肝硬化失代偿、HCC及其他并发症的发生,从而改善生活质量和延长生存时间。正如上面所述,乙型肝炎病毒的特殊性以及肝细胞损伤免疫机制的参与,说明仅仅抗病毒治疗还不够,必须同时进行免疫调节治疗,打破免疫耐受状态更有利于抑制甚至清除病毒。已经上市的抗乙肝病毒药物有两大类:核苷(酸)类似药物(nucleos/tide analogues,NAs)和干扰素(interferon alpha,IFN-α),目前推荐的一线抗病毒药物有恩替卡韦(enticavir,ETV)、替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)、替诺福韦艾拉酚胺富马酸(Tenofovir alafenamide fumarate,TAF)和聚乙二醇干扰素(PegIFN-α)。NAs的单药治疗很难达到理想的治疗目标(HBsAg清除)和满意的治疗目标(HBeAg清除);干扰素单药治疗副作用较大,PegIFN-α治疗1年HBsAg清除率为3%。在我国ETV广泛用于临床。ETV是一种NAs,可通过与三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷竞争,抑制HBV多聚酶的活性,临床上主要应用于病毒复制活跃,转氨酶持续升高的成年患者。《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》中指出,HBeAg阳性慢乙肝患者使用恩替卡韦单药治疗48周后,HBV DNA转阴率为67%,HBeAg血清学转换率为21%,转氨酶复常率为68%;持续治疗5年后HBV DNA转阴率为94%,转氨酶复常率为80%。恩替卡韦单药治疗很难实现HBs Ag阴转,有研究表明恩替卡韦治疗1年未能观察到HBsAg的清除。为了提高HBeAg血清学转换率和HBsAg清除率,达到满意的和理想的治疗目标,临床需要不断的探索新的治疗方案,同时期待新的特效药的研发上市。国内一些学者在临床上开展了核苷类抗病毒药物联合干扰素进行序贯疗法,疗效不尽如人意。本文研究中,我们在常规ETV治疗的基础上联合使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)治疗CHB,以期待调节病人的免疫功能,提高HBe Ag和HBsAg的清除率。选择临床初诊的HBeAg阳性CHB患者,随机分成两组,对照组(ETV组)服用ETV(0.5mg,qd);观察组(ETV+GM组)在每天口服ETV(0.5 mg,qd)的基础上,于治疗第1周、第4周、第12周、第24周和第48周的第3、4、5天,给患者皮下注射100μg GM-CSF。定期检测患者外周血中的HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT和中性粒细胞水平;分离患者外周血中的单个核细胞,利用流式细胞技术检测CD3-CD56+CD16+细胞中CD56、CD45RA、CD69的表达水平;纯化外周血中的NK细胞,利用western blot方法检测NK细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路蛋白mTOR(Ser2448)、mTOR(7C10)、p70 S6K和4EBP-1等蛋白的磷酸化水平。本研究中,我们收集了22例ETV治疗和24例ETV联合GM-CSF治疗慢乙肝患者(HBeAg阳性)的血液标本和临床资料。治疗12周时,ETV组中有2例HBV DNA阴转,阴转率为9.1%,HBeAg均没有转阴;ETV+GM-CSF组有5例HBV DNA阴转,阴转率为20.8%,3例HBeAg阴转(阴转率12.5%)。治疗24周时,ETV组有6例显示HBV DNA阴转(阴转率27.3%),1例HBeAg阴转(阴转率4.5%);ETV+GM-CSF组有6例实现HBV DNA阴转(阴转率25%),HBeAg阴转率还是12.5%。治疗36周时,ETV组有10例HBV DNA阴转(阴转率45.5%),2例HBeAg阴转(阴转率9.1%);ETV+GM-CSF组有11例实现HBV DNA阴转(阴转率45.8%),HBeAg有4例转阴(阴转率16.7%)。结果提示ETV+GM-CSF联合抗病毒治疗可以加快实现促进HBeAg的清除。分离这些患者不同时间外周血中的单个核细胞,流式细胞术检测淋巴细胞中NK细胞(CD3-CD56+CD16+)比例,ETV组和ETV+GM-CSF组患者治疗前外周血中的CD3-CD56+CD16+细胞占淋巴细胞总数的比例为11.86±2.20%和11.59±5.71%;治疗12周时的比例为13.85±4.80%和11.28±4.96%;治疗24周时的比例为12.79±3.14%和12.93±9.7%;治疗36周时的比例为11.09±6.95%和12.47±3.49%。统计结果表明,两组患者NK细胞占淋巴细胞比例在各个时间点上都没有差异。患者外周血中CD3-CD56+CD16+细胞大都表达CD45RA分子。ETV组和ETV+GM-CSF组中CD45RA+CD69-NK细胞比例在第0、12、24和36周时分别是(29.18±21.76%vs 36.14±22.32%)、(35.00±32.44%vs 61.03±10.54%)、(51.30±28.32%vs 55.13±29.29%)、(87.45±4.2%vs 81.31±2.393%)。ETV组和ETV+GM-CSF组中CD45RA+CD69+NK细胞比例在第0、12、24和36周时分别是(67.27±20.99%vs 62.60±22.91%)、(58.71±32.46%vs43.10±28.16%)、(47.79±28.71%vs 35.81±12.08%)、(11.90±3.83%vs15.98±6.86%)。慢乙肝患者抗病毒治疗后,CD45RA+CD69-NK细胞亚群比例升高,在治疗12周时,ETV+GM-CSF组患者外周血中的CD45RA+CD69-NK细胞比例显著高于ETV组,说明GM-CSF可以促进CD45RA+CD69-NK细胞的增殖(P=0.014)。随着抗病毒治疗的进行,患者外周血中CD45RA+CD69+NK细胞频数逐渐降低,血清中HBV DNA载量也逐渐下降,相关性分析表明HBV DNA下降与CD45RA+CD69+NK细胞频数的降低有相关性。分离纯化患者外周血中的NK细胞,检测mTOR信号通路相关蛋白的磷酸化水平。Western blot结果显示,与HC组相比,ETV组和ETV+GM-CSF组患者的NK细胞内mTOR(Ser2448)和p70 S6激酶的磷酸化水平升高,mTOR(7C10,Ser2481)和磷酸化的4EBP1的表达下调。与ETV组相比,ETV+GM-CSF组患者外周血中NK细胞mTOR(7C10,Ser2481)和磷酸化的4EBP1的表达上调,磷酸化的p70 S6激酶水平下调。综上所述,治疗12周时,ETV+GM-CSF联合抗病毒治疗可以加快慢乙肝患者外周血中的HBeAg阴转率;增加外周血中CD3-CD56+CD16+细胞中CD45RA+CD69-亚群的比例,降低CD45RA+CD69+NK细胞频数;上调NK细胞mTOR(7C10)和4EBP1的磷酸化水平,下调mTOR(Ser2448)和p70 S6的磷酸化水平。
【学位单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R512.62

【参考文献】