肝细胞调控肝血窦内皮细胞影响肝再生机制及肝损伤干预新策略

发布时间：2020-09-17 14:30

　　第一部分肝细胞调控肝血窦内皮细胞促进肝再生机制研究研究背景和目的肝脏在遭受到外力损伤,化学毒物暴露,或者病毒感染时,具有显著的再生能力,来维持肝脏的结构和功能。肝再生是一个由不同种类的细胞共同参与的持续的自然过程。小鼠肝部分切除模型(Partial Hepatectomy,PHx)是用来研究肝再生最经典的模型。在这个模型中,70%的肝脏被手术切除,剩下的肝脏增殖,大约术后1周,达到原来的肝脏体积,之后再生过程停止。肝再生是如何被触发的,在再生过程中肝脏的结构和功能是如何保持的,哪些信号负责关闭生长反应是肝脏再生的三个主要问题。肝脏结构主要由肝实质细胞、肝血窦内皮细胞(Liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)、肝内胆管上皮细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)、Kupffer细胞和细胞外基质组成。肝细胞增殖在前,非实质细胞再生随后。正常组织结构恢复过程中,星状细胞在部分肝切除术后约4天产生细胞外基质,重建肝细胞与其他细胞之间的连接。肝内血管系统主要由动脉、静脉和LSEC构成。肝再生后期,势必需要建立丰富的血管系统来维持新生肝细胞的存活,肝内血管再生离不开肝脏内特殊的毛细内皮系统。LSECs约占肝脏内细胞的15-20%,形成肝窦壁,参与了不同的生理和病理过程。肝细胞和LSECs的平衡对于肝再生稳态的维持尤为重要,它有助于新生肝细胞的存活和肝脏功能保护。LSEC对肝细胞的增殖与终止是至关重要的,但启动LSEC的再生过程仍不清楚。研究方案1.检测PHx后肝细胞与LSEC增殖的时相,探讨导致两者时相差的原因;2.论证CRISPR-Cas9联合AAV技术用于肝再生研究的可行性;3.基于CRISPR-Cas9联合AAV技术构建特异性抑制肝细胞增殖的肝再生模型,观察LSEC再生情况;4.筛查并验证肝细胞调控LSEC再生的关键因子,明确调控机理;5.探讨肝细胞对内皮前体细胞分化形成LSEC的影响。研究结果1.发现肝再生中,肝细胞增殖高峰早于LSEC增殖高峰的可能原因;2.首次论证了CRISPR-Cas9技术用于肝再生研究的可行性。3.基于CRISPR-Cas9技术构建了肝细胞特异性敲除OSMR(OSMR~(ΔHep))和Met(Met~(ΔHep))的肝再生模型,发现抑制肝细胞增殖后,LSEC以及肝脏内的血管再生滞缓,提示肝细胞启动了LSEC再生过程;4.肝切除术后分离肝脏中的肝细胞、HSC、Kupffer和LSEC,分别进行了多因子筛查检测,对比分析显示肝细胞中促进内皮细胞生长的细胞因子VEGFA表达水平显著上调,而抑制内皮细胞生长的细胞因子PEDF表达水平显著下调;进一步结合OSMR~(ΔHep)以及Met~(ΔHep)模型,提示了肝细胞可能通过上调VEGFA以及下调PEDF来促进LSEC再生。5.体内注射VEGFA中和抗体以及PEDF因子,可以显著滞缓LSEC再生;6.肝细胞特异性敲除VEGFA(VEGFA~(ΔHep))的小鼠肝切除术后,LSEC增殖滞后;而它在LSEC、Kupffer以及HSC内的敲除不影响肝体比恢复速率以及LSEC再生;肝细胞过表达PEDF(PEDF~(Hep))小鼠肝切除术后LSEC增殖滞后;以上实验证实了肝细胞可通过上调VEGFA以及下调PEDF来促进LSEC再生;7.结合内皮前体细胞分析显示,肝再生过程中,肝细胞可通过上调VEGFA及下调PEDF,促进骨髓中CD133阳性的内皮前体细胞动员、定植入肝,分化形成LSEC过程。结论我们的研究发现了肝再生过程中肝细胞可启动LSEC再生,深入探讨了肝细胞调控LSEC再生的方式,揭示了肝细胞影响骨髓CD133阳性内皮前体细胞分化形成LSEC的机理。肝再生早期伴随着肝细胞的快速增殖,肝细胞通过上调VEGFA同时下调PEDF(PHx后第2-3天),促进LSEC的快速增殖;同时还促进骨髓中CD133阳性的内皮前体细胞,进入血液中(PHx后第2-3天),定植肝内(PHx后第2-4天),分化形成LSEC(PHx后第4-7天)。LSEC的部分再生过程依赖于骨髓内皮前体细胞定植分化,本研究结果解释了为什么VEGFA和PEDF在肝细胞内变化高峰(PHx后第2-3天)与内皮细胞增殖高峰(PHx后第4-5天)存在2-3天的时间差。第二部分靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂在肝癌防治中的不同作用研究背景和目的肝脏具有的独特快速再生能力,可避免在急/慢性损伤或肝细胞死亡后对肝脏正常功能的影响。然而,在慢性损伤的情况下,驱动肝脏再生的分子机制是导致肝细胞癌变的主要危险因素,这也解释了肝细胞癌的发生通常伴有慢性肝病的基础,如肝硬化和慢性肝炎。伴随着肝脏的损伤存在着持续的肝脏再生,其中,细胞积累活性氧簇与抗氧化调控失衡是导致致癌突变引发肝癌的主要原因之一。长久以来,人们普遍认为抗氧化剂能够中和活性氧(ROS)来减少氧化应激产生的损伤,因此认为抗氧化剂具有一定的预防和辅助治疗肿瘤的作用。然而越来越多的随机对照实验以及基础研究表明结果与此相反,即抗氧化剂对肿瘤不但没有防治作用,甚至某些特殊情况下还会增加肿瘤罹患的风险;这进一步说明了抗氧化剂在肿瘤预防中的双重作用,而且抗氧化剂对不同种类的肿瘤作用也不同。此外,循证医学提示抗氧化剂的种类也是会影响肿瘤预防的效果。总体而言,为了合理地使用抗氧化剂,需要区分肿瘤类型以及抗氧化剂的种类。然而,使用不同种类的抗氧化剂对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生的结局仍然未知。本文综合国内外有关抗氧化剂在肿瘤预防和治疗中的应用和进展,研究了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向型抗氧化剂在肝癌防治中的作用,分析了这两类抗氧化剂促进或抑制肿瘤的具体机制,并提出抗氧化剂的类型是影响其用于肝癌防治不同效应的重要因素,从而为抗氧化剂在肝癌防治中的合理应用提供了理论依据。研究方案1.建立DEN和DEN联合CCl4诱导的两种肝癌模型,给予靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向型抗氧化剂,研究两类抗氧化剂对HCC形成的影响;2.检测给予不同种类抗氧化剂后,肝细胞内总ROS和线粒体内ROS的变化情况,以明确这两类抗氧化剂的作用部位;3.转录本测序分析抗氧化剂处理后肝脏样本基因转录水平的变化;4.根据芯片数据探讨抗氧化剂对肝细胞DNA损伤的影响和作用机制。5.检测给予不同种类抗氧化剂后,DNA损伤,损伤反应相关蛋白以及修复相关蛋白在两组之间的变化情况,明确调控机理;6.探讨改变ATM/ATR活性对不同类型抗氧化剂防治HCC形成过程的影响。研究结果1.靶向线粒体型抗氧化剂(SS-31、Mito-Q)促进HCC的形成,非靶向线粒体型抗氧化剂(NAC、Trolox)抑制HCC的形成;2.非靶向线粒体型抗氧化剂降低了细胞内总的ROS;相比而言,靶向线粒体型抗氧化剂除降低细胞内总的ROS外,还特异性降低了线粒体内的ROS;3.转录本测序数据提示靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂对肝细胞内氧化还原状态的影响不同,多条信号通路分析提示它们对DNA损伤反应的影响不同;4.体内外实验证实靶向线粒体型抗氧化剂促进了肝细胞中DNA损伤,非靶向线粒体型抗氧化剂则抑制了该损伤;5.升高SS-31降低线粒体内ROS,可以抑制SS-31所导致的DNA损伤;6.靶向和非靶向线粒体型抗氧化剂对肝细胞内DNA损伤反应以及DNA修复相关蛋白影响不同;7.靶向线粒体型抗氧化剂抑制ATM/ATR及其下游信号通路,促进ATM在线粒体内富集,并减少核内ATM分布;而非靶向线粒体型抗氧化剂进一步活化该通路,促进ATM核内富集,减少线粒体内ATM分布;8.改变ATM/ATR活性可逆转不同类型抗氧化剂对HCC的防治效果。结论本研究发现了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向线粒体型抗氧化剂对化学诱发肝癌的不同防治效果;揭示了非靶向线粒体型抗氧化剂NAC和Trolox可促进原代肝细胞中DEN损伤的DNA修复过程,减缓了HCC形成;而靶向线粒体型抗氧化剂SS-31和Mito-Q则抑制了DNA修复,促进了HCC;阐述了靶向线粒体型抗氧化剂和非靶向线粒体型抗氧化剂在HCC防治中的不同作用与线粒体内ROS和非线粒体内ROS在HCC形成中的不同作用有关,线粒体内外ROS的失衡可能诱导了DNA损伤进而促进了HCC形成。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575
【部分图文】：

内皮细胞增殖,高峰,肝再生

图 1 肝再生中肝细胞增殖高峰早于内皮细胞增殖高峰。Figure 1. Hepatocytes proliferation is prior to LSECs after hepatectomy.A) Representative fluorescent microscopy of liver sections obtained from wide typice after partial hepatectomy (PHx). Hepatocytes were marked by HNF4α (red), live

有效性,技术

图 2 CRISPR-Cas9 技术在肝再生模型中有效性的验证Figure 2. The efficiency of CRISPR-Cas9 combined with adenovirous-associated virus(AAV) technology in liver regeneration mouse model.(A) Living body imaging of mice after injected with AAV.(B) Representative immunostaining of lucificanse in liver sections from Cas9-Alb-cre

筛查,细胞因子,肝内

图 4 肝内各类细胞群中的细胞因子经筛查显示，肝细胞来源的 VEGF 和 PEDF 调控了 LSEC 再生。Figure 4. Differential gene expression analysis of individual liver cell populationspresented hepatocyte-drived VEGF and PEDF to regulate LSEC proliferation.(A) qRT-PCR analysis of the biomarkers of isolated hepatocytes (Met), HSC (GFAP andDesmin), Kupffer (F4/80 and CD11b) or LSEC (Tie2 and VEGFR2) from wild type (WT)mice after PHx.(B) qRT-PCR analysis of the cytokines of promoting LSEC mitosis. VEGFA was thepossible cytokine. (n=4 animals)(C) qRT-PCR analysis of the cytokines of inhibiting LSEC mitosis. PEDF was thepossible cytokine.(D) qRT-PCR analysis of VEGFA and PEDF of isolated hepatocytes from WTOSMRΔHepand MetΔHepmice after PHx.(E) Quantification of VEGFA and PEDF by ELISA in liver sections from wild type miceafter PHx.

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