NF-κB信号通路在胆汁淤积性肝损伤中的作用机制研究

发布时间：2020-09-22 19:45

　　研究目的胆汁淤积性肝病是由多种原因所致的胆汁淤积造成肝脏损伤的病理过程,可引起肝细胞损伤,炎症反应,若持续进展,可引起肝脏纤维化,最终发展称肝硬化。目前,关于胆汁淤积造成肝损伤的具体分子机制仍不清楚,本研究旨在探索NF-κB信号通路在胆汁淤积性肝损伤中的作用机制。研究方法以小鼠胆总管结扎手术建立胆汁淤积性肝损伤模型,结扎2周后检测各组小鼠血清标本中肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)变化,肝脏组织HE染色观察小鼠肝脏病理变化。通过免疫荧光染色实验(IF)检测相关蛋白表达定位。取结扎3天后各组小鼠肝脏组织标本进行转录组测序,以检测肝脏组织中促炎因子的mRNA水平表达变化,同时使用免疫印迹实验(WB)检测组织中NF-κB信号通路相关指标的蛋白表达差异。体外实验中,使用胆汁酸成分甘氨鹅脱氧胆酸(GCDC)或牛黄胆酸(TCA)刺激人正常肝细胞LO2细胞24小时后,荧光定量PCR检测细胞因子和炎症因子等mRNA表达水平变化,然后使用NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082与胆汁酸GCDC或TCA共同刺激LO2细胞24小时后,用荧光定量PCR实验检测不同组之间相应炎症因子mRNA水平,用免疫印迹实验检测NF-κB信号通路蛋白的表达变化。最后体内给予胆管结扎小鼠BAY 11-7082,2周后,检测血清肝功能指标ALT、AST变化,肝脏组织HE染色观察肝脏病理变化。研究结果1.胆总管结扎术后2周,可见BDL组小鼠胆管明显扩张,胆管中大量胆汁潴留,HE染色显示出现大量多发坏死灶,汇管区胆管增生,炎症细胞浸润明显,肝功能指标ALT、AST明显上升。而假手术组是正常的。免疫荧光染色实验提示BDL组在坏死灶区的蛋白RIP1和RIP3表达上升。2.胆管结扎术后3天,与假手术组相比,BDL组细胞因子IL-6,趋化因子IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20的mRNA表达水平明显上升,WB实验显示肝组织中的NF-κB p-p65和p-IκBα的蛋白水平上升。3.体外使用胆汁酸GCDC和TCA刺激LO2细胞24小时后,蛋白RIP1、RIP3表达上升。细胞因子IL-6,趋化因子IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20的mRNA水平上升明显。p-p65、p-IκBα的蛋白水平上升,使用抑制剂BAY 11-7082和胆汁酸共同刺激24小时后,p-p65、p-IκBα的蛋白水平下调,细胞因子IL-6,趋化因子IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20的mRNA的表达下降。4.体内给与胆管结扎小鼠BAY 11-7082,2周后,与BDL组相比,血清中ALT、AST水平下降,HE染色显示,予以小鼠BAY 11-7082后,肝脏坏死灶面积减少。研究结论小鼠胆总管结扎模型可以观察到NF-κB信号通路的激活,并伴随有下游炎症因子的表达上调。在体外,胆汁酸可通过磷酸化IκBα,释放NF-κB,激活NF-κB信号通路,并磷酸化NF-κB p65,促进下游促炎基因的转录,该通路的激活能被NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082所抑制。体内应用BAY 11-7082,可以减轻胆管结扎所致肝损伤。胆汁酸通过激活NF-kB通路诱导炎症反应,但关于胆汁酸如何激活NF-κB通路以及胆汁淤积性肝损伤的具体分子机制有待进一步研究。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575
【部分图文】：

胆管结扎,小鼠,胆汁淤积,肝损伤

22图 1. 小鼠胆管结扎诱导胆汁淤积性肝损伤小鼠胆管结扎两周后，A.小鼠术后解剖示胆管扩张情况，B.小鼠肝脏组织切片HE 染色，C.小鼠血清 ALT 水平，D.小鼠血清 AST 水平。n=5, ***P<0.01，与Sham 组相比。.

胆管结扎,炎症因子,表达水平,肝组织

图 2. 胆管结扎小鼠肝组织促炎因子表达水平升高小鼠胆管结扎 3 天后，肝组织测序结果显示炎症因子表达水平，A、B、C、D、E 分别为 IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20 的 mRNA 水平，n=5, ***P<0.01，与 Sham 组相比。

信号通路,胆管结扎,相关蛋白,内参

图 3. 胆管结扎小鼠肝组织 NF-κB 信号通路激活结扎 3 天后，检测肝脏组织中 NF-κB 信号通路相关蛋白，p-IκBα，Iκ65，p65 蛋白变化，β-Actin 为内参。

【相似文献】