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克罗恩病的内镜学特点及病因学研究

发布时间:2020-09-27 18:29
   背景和目的 克罗恩病(Crohn's disease,CD)是炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的一个主要类型,是一种肠道节段性分布的,慢性透壁性炎性肉芽肿性疾病,可见于全消化道,好发于小肠,多为小肠结肠炎。CD在欧美国家较为常见,发病率约为1~10/10万左右。我国患病率较低,无确切统计,但近20年来,随着国内临床医生对CD的认识加深,以及双气囊小肠内镜的应用,CD发病率在我国有逐年上升趋势。该病病因及发病机制至今不明,临床表现复杂多样,易误诊,目前尚无彻底治愈方法,常用药物治疗效果欠佳,罹患者即使在手术切除病变肠段后,也可能会复发而成为终身致残性疾病,严重危害人类健康。 近年来的观点认为,携带遗传易感基因的宿主在环境因素参与下,免疫功能紊乱,最终导致疾病发生。研究发现NOD2/CARDl5基因序列单核苷酸多态性(single nucleotide Polymorphisms,SNP)与CD明显相关,发现并证实其第4、8、11上有3个SNP(R702W,G908R,3020 insC)与欧美白种人CD显著相关,并且认为NOD2/CARD15基因突变与发病年龄、病变部位及临床特征有关。上述现象在德国、澳大利亚及英国等人群中均得到验证,但在日本、我国香港和浙江地区的小样本研究并未发现上述3个SNP的改变。由于CD存在着明显的种族差异性,相对于西方人群的易感基因不一定适用于我国人群,而且CD同其它复杂疾病一样,单一基因改变并不一定能引起疾病的发生,基因之间的相互作用以及同环境之间的相互作用更能解释疾病的发病机理,因此,确定我国人群CD发病相关的易感基因,进行连锁及群体关联分析,对阐明我国汉族人群CD的发生发展显得更为紧迫。 目前,国外多项研究证明CD是一种复杂的多基因疾病,遗传因素与环境因素相互作用导致CD的发病已逐渐被认可,因此,从基因水平上研究CD的发生发展及临床特征,是目前研究的主流,其主要任务是阐明其发病的病因及发病机制,寻找其相关的易感基因,对这一研究的突破不仅能使我们更好地理解CD发生的病理生理机制,而且还将能指导我们对CD进行早期诊断、预防和治疗。 NOD2/CARD15基因已被证实在白色人种CD发病中起重要作用,与显著相关的NOD2/CARD15基因的SNP位点有R702W、G908R、3020insC等。NOD2/CARD15基因是否是中国CD的易感基因,这些位点与中国人CD发病是否相关,以及是否存在其他与中国人CD发病相关的NOD2/CARD15基因突变位点?目前尚无相关报道。我们拟对NOD2/CARD15基因12个外显子进行DNA测序,用PCR—RFLP法验证突变位点并探讨其在溃疡性结肠炎(ulccerativecolitis,UC)及健康人群的分布频率,发现与中国人CD发病相关的SNP以及SNP与CD临床特征的相关性,为进一步研究CD发病机制奠定基础,为防治该病提供理论依据。同时,为了提高克罗恩病的镜下诊断,本研究回顾性分析155例经双气囊内镜检查的患者,以探讨双气囊内镜对小肠疾病的诊断价值。 方法 回顾性分析155例怀疑小肠病变并经双气囊内镜检查的患者的临床特点。同时收集南方医院消化科及普外科确诊临床资料完整、彼此无血源关系的广东及外省籍CD患者48例(诊断按太原标准);溃疡性结肠炎(诊断按太原标准)患者及门诊健康体检者(健康对照,HC)各50例。抽取外周血,提取白细胞基因组DNA,根据NOD2/CARD15基因12个外显子设计15对引物,PCR扩增目的片段。 1.成功扩增48例CD患者NOD2/CARD15基因12个外显子后,将PCR产物纯化,然后通过ABI377和ABI3730测序仪采用双脱氧四色荧光法全自动测读序列,并与基因库数据对照,发现突变位点后,对该序列进行反向测序,明确该突变位点确实存在,并用同样的一对引物扩增50例溃疡性结肠炎患者和50例健康者NOD2/CARD15基因相应目的片断,纯化PCR产物,用同样的方法测序并与基因库数据对照。 2.根据P268S突变位点设计酶切引物及选择相应的内切酶,PCR扩增目的片段,成功扩增后,用BamHI酶切鉴定已发现的P268S突变位点。并探讨其在UC组及健康者组中的发生频率。 3.通过转化、扩增出野生型NOD2蛋白真核表达载体(pcDNA-wild-NOD2-HA),应用定点突变技术构建、克隆出P268S突变型NOD2蛋白真核表达载体(pcDNA-NOD2-P268S-HA)。 4.成功构建出P268S突变型NOD2蛋白真核表达载体后,把实验分成空白对照组、pcDNA3.0空载体组、pcDNA-wild-NOD2-HA组,pcDNA-NOD2-P268S-HA共4组;利用阳离子质脂体介导体外转染技术瞬时转染人胚肾细胞,再通过western Blot及RT-PCR法检测NOD2蛋白的表达。 5.各实验组瞬时转染48小时后LPS刺激细胞30分钟,然后用western Blot及免疫荧光定位技术检测转染细胞中的NF-κB核内移变化,比较各实验组中核内NF-κB的表达水平。 结果 1.155例行双气囊小肠内镜检查的患者中125例发现病变,阳性率为80.6%,检出的主要疾病有小肠溃疡(含克罗恩病)、慢性炎症、Meckel憩室、间质瘤、血管畸形、小肠癌等。其中92例怀疑小肠出血者,84例检出病变,阳性率91.3%;39例腹痛患者,检出病变24例,阳性率61.5%;腹泻、腹胀、消瘦的23例,检出病变16例,阳性率69.6%;1例腹泻伴顽固性低蛋白血症者诊断为淋巴管扩张症。病变分布,位于胃及十二指肠9例,小肠病变115例,大肠病变1例,全消化道未发现病变30例。小肠病变者中溃疡性病变43例,其主诉为反复消化道出血者27例,腹痛9例,腹胀4例,消瘦2例,腹泻1例;病灶数为单个的12例,多个(2个及以上)31例;病变位于空肠的18例,回肠20例,空肠和回肠都有病变的5例。双气囊内镜结合组织学检查对Meckel憩室、间质瘤、癌、血管病变、肠黏连的诊断,与手术后诊断是完全相符的;而对溃疡性病变(主要是克罗恩病)的诊断与手术后诊断却相差较大,符合率为4/7(57.1%)。检查中发生小肠穿孔和急性肠梗阻并发症各1例,均经及时处理而痊愈。 2.通过DNA测序及PCR-RFLP酶切验证,有5例CD患者发现有P268S突变,其中3例为杂合子改变,2例为纯合子改变,发生率为10.4%,其碱基有C变成T,密码子有CCC变成UCC,编码的氨基酸有脯氨酸变为丝氨酸,而UC组和HC组没有发现1例P268S突变,各组间差异有统计学意义(Fisher精确概率检验P=0.003),在对NOD2/CARD15基因12个外显子其他片段的测序中没有发现新的突变位点。提示P268S可能是NOD2/CARD15基因与中国人相关的突变位点。所有病例没有发现1例有R702W,G908R及3020 insC三个常见于西方人的基因多态位点。 3.48例CD患者中,12例发病年龄小于20岁的患者中有4例发现P268S突变,36例发病年龄大于20岁的患者中只有1例发现P268S突变,按Fisher精确概率检验(下同),两组比较差异有统计学意义(P=0.011),说明P268S突变与CD患者的发病年龄明显相关。36例男性患者中发现3例P268S突变,12例女性患者中发现2例P268S突变,两组比较差异无统计学意义(P=0.587),说明P268S与CD患者的性别无相关性。5例有P268S突变者病变部位均在回肠,而病变位于结肠及其他者未见1例P268S突变,,各组间比较差异有统计学意义(P=0.001),说明P268S突变与CD患者的发病部位有明显相关性,有P268S突变的CD患者病变部位主要在回肠。5例有P268S突变的患者全部并发有肠腔狭窄,而32例无并发肠腔狭窄的患者中无1例有P268S突变,两组间比较差异有统计学意义(P=0.003),说明P268S突变与CD患者的并发症有明显相关性,有P268S突变的CD患者较易并发肠腔狭窄、肠梗阻。26例中度病变的患者中发现4例P268S突变,11例重度病变的患者中发现1例P268S突变,两组间比较差异无统计学意义(P=0.289),说明P268S突变与CD患者的病变程度无明显相关性。 4.经克隆、酶切鉴定及基因测序证实成功获得P268S突变型NOD2蛋白真核表达载体。各表达载体瞬时转入人胚肾细胞48小时后,western Blot及RT-PCR分别验证NOD2蛋白得到有效表达。P268S突变型与野生型NOD2蛋白的表达均能增强LPS刺激后HEK293T细胞中NF-κB的核内移水平,但两者之间的差别不明显。 结论 1.对克罗恩病而言,双气囊内镜是安全、有效的诊断方法,特别在发现小肠的病灶方面,但仅靠溃疡的形状、数目(即使结合内镜组织活检),对克罗恩病的诊断也未必是特异的,及时行外科处理对某些溃疡性病变的诊断和治疗都是有益的。 2.P268S可能是NOD2/CARD15基因与中国人CD发病明显相关的SNP,而与UC无关。 3.除P268S外没有发现新的突变位点。 4.我们的研究未发现R702W,G908R及3020 insC三个常见于西方人CD的基因多态位点。 5.P268S与CD的发病年龄、病变部位及并发症有关,而与患者的性别及病变严重程度无关。有P268S突变的患者发病年龄多小于20岁、病变部位多在回肠且容易出现肠腔狭窄并发肠梗阻而需手术治疗。说明NOD2/CARD15基因可能是部分中国人CD发病的易感基因。 6.P268s突变型与野生型NOD2蛋白均能增强LPS刺激后HEK293T细胞中的NF-κB的活化水平,表明NOD2蛋白的表达可以促进293T细胞的免疫反应,增强细胞抵抗外界刺激能力。 7.P268S突变型与野生型NOD2蛋白对增强LPS刺激后细胞中的NF-κB活化水平的差别并不明显。
【学位单位】:南方医科大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2007
【中图分类】:R574
【部分图文】:

克罗恩病,空肠


小肠克罗恩病小肠克罗恩病致肠腔狭窄

小肠疾病,克罗恩病,憩室,空肠


其它小肠疾病内镜表现

电泳图,电泳图,引物,外周血白细胞


结果1、CD患者外周血白细胞 NODZ/CARD15基因12个外显子的PCR扩增电泳图(见图2一fa~2一10):注:MI为。arkerl,产物大小255bp图2一la引物l扩增的PCR产物电泳图Fig.1一laeleCtr0PhoresisofNODZ PCRProduet印 叮PlifiedbyPrimerl注:m2为markerll,产物大小635bp图2一1b引物2扩增的PCR产物电泳图Fig.l一 lbelee加 PhoresisofNODZ PCRProduct别叮Plified勿Pr诵erZ

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 刘万清,贺林;SNP-为人类基因组描绘新的蓝图[J];遗传;1998年06期

2 巫协宁,周怡和;炎症性肠病的诊治经验[J];中华消化杂志;2003年09期



本文编号:2828219

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