RKIP在肝星状细胞粘附过程中的作用

发布时间：2020-10-09 00:34

　　肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化乃至肝功能衰竭的病理基础,因而,阻止肝纤维化发生这一过程已经成为国内外研究慢性肝病的中心议题。在这一过程中细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的生成和降解失衡,其量和质发生变化,从以Ⅳ型胶原组成为主,变为以纤维胶原组成为主(如Ⅰ型、Ⅲ型胶原)。由此肝脏的质地、韧度及血流动力学发生改变,使肝功能出现异常,并且可能引起多种并发症。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)在月纤维化过程中被激活并转化为肌成纤维细胞,生成细胞外基质及一系列生长因子、促炎因子,这奠定了HSCs在肝纤维化过程中的中心地位。因此,干预HSCs、影响其生物学行为是阻断、减轻甚至逆转肝纤维化的研究切入点。 Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein, RKIP)是1999年被Yeung K等利用酵母双杂交筛选法分离出的一种Raf激酶抑制蛋白,它可以与Raf-1结合抑制其磷酸化MEK,从而抑制Raf-1/MEK/ERK1,2信号通路的激活,进而可以影响HSCs的增殖分化等生物学行为。近年来RKIP在癌症中的功能和作用研究较多,同时国内有研究证实RKIP可以抑制HSCs细胞的增殖,促进HSCs的细胞迁移。本研究我们将揭示RKIP在HSCs粘附过程中的作用。目的：本文主要通过RKIP过表达及RNAi技术,模拟不同生理病理状态下ECM成分的改变,探讨RKIP对HSCs粘附功能的影响。方法：实验LX-2细胞共分四组,分别是RKIP过表达组(RKIP-Ad)及阴性对照组(GFP-Ad);应用用RNAi技术的RKIP抑制组(RKIP-RNAi-Ad)及阴性对照组(NC-GFP-Ad)。首先确定细胞感染病毒的最适MOI(multiplicity of infection)值：体外培养传代LX-2细胞株,72h传代一次。当细胞融合至80%左右时开始给予感染病毒,MOI值设四个水平,分别是5、10、15、20。于12h、24h、48h时在倒置荧光显微镜下观察细胞状态,计数细胞荧光数,通过流式细胞术进行感染率的验证,筛选出最适MOI值及感染时间。其次确定感染病毒后是否确有RKIP的过表达和抑制：以最适MOI值及感染时间感染细胞,Western Blot方法验证各组RKIP表达情况。应用透射电镜观察细胞间连接。已干预好的细胞稀释成1.0×105/ml的浓度种在盖玻片和已准备好的由Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、1matrigel及fibronectin包被的24孔板中,每种干预设3个复孔,1h后200×下取12个视野计数粘附的细胞数,资料数据以均数±标准差(x±s)表示,进行统计分析。结果： 1人HSCsLX-2细胞株的腺病毒感染率可达到80%～90%。适宜的MOI值为5,感染时间为48h。感染时间过短,荧光表达率低;MOI值过大则细胞毒性过大,细胞状态变差,甚至碎裂。 2RKIP过表达组较对照组蛋白表达增多(3.47±0.02vs1.74±0.13,P0.05,n=3)。RKIP抑制组较对照组蛋白表达明显减少(0.29±0.06vs0.73±0.14,P0.05,n=3)。 3RKIP过表达促进HSCs在glass上的粘附,过表达组和抑制组的粘附细胞数分别为(158±68vs81±12,P0.05,n=12)。RKIP的低表达,抑制其在glass上的粘附(83±10vs131±43,P0.05,n=12)；RKIP在HSCs与基质的粘附上的作用与在glass上的作用相反。RKIP的过表达抑制HSCs与matrigel、I型胶原、Ⅳ型胶原及纤维连接蛋白的粘附。Matrigel上RKIP过表达组与对照组分别为(80±14vs152±42,P0.05,n=12)；Ⅰ型胶原上为(70±13vs138±36,P0.05,n=12)；Ⅳ型胶原(92±6vs124±32,P0.05,n=12)；纤维连接蛋白(133±27vs276±106,P0.05,n=12)；而RKIP的抑制组促进HSCs与以上基质的粘附,Matrigel基质胶表面的粘附为(170±25vs66±12,P0.05,n=12)；Ⅰ型胶原表面粘附为(200±25vs82±13,P0.05,n=12)；Ⅳ型胶原为(167±22vs96±14,P0.05,n=12)；纤维连接蛋白为(276±28vs96±17,P0.05,n=12)。结论：RKIP在肝星状细胞粘附的过程中发挥一定的调节作用：RKIP促进HSCs在glass上的粘附,抑制其在Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、matrigel及纤维连接蛋白上的粘附。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R575.2
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
材料与方法
结果
附图
讨论
结论
参考文献
综述
REFERENCES
致谢
个人简历

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