乙型肝炎病毒X基因促进肝卵圆细胞增殖及其分子机制的研究

发布时间：2020-10-09 04:40

　　第一节HBX在体外对肝脏卵圆细胞增殖的直接促进作用目的:研究乙型肝炎病毒编码X蛋白在体外对肝脏卵圆细胞增殖的促进作用. 方法:运用荧光显微镜观察及Western blot对稳定表达HBX的大鼠肝脏卵圆细胞系HBX-EGFP-LE/6进行鉴定。以转染HBX细胞系HBX-EGFP-LE/6为实验组,转染标记绿色荧光蛋白空载体EGFP-LE/6、LE/6细胞系为对照组,通过MTT细胞增殖活力实验及EDU掺入实验比较三组细胞DNA合成速度。结果:HBX在部分细胞克隆稳定高表达,对照组细胞未检测到HBX表达。HBX对肝脏卵圆细胞的增殖具有促进作用,在同步化后培养24h、48h、72h,与对照组相比,HBX-EGFP-LE/6卵圆细胞系增殖加快,差异有统计学意义(p0.01)。在血清刺激后,与对照组相比,HBX-EGFP-LE/6卵圆细胞系DNA合成加快,差异有统计学意义(p0.01)。结论:细胞内稳定转染并表达的HBX蛋白对体外培养的肝脏卵圆细胞的增殖具有直接促进作用,并且促进其S期DNA合成。第二节HBX对卵圆细胞周期蛋白表达的调控作用目的:研究HBX对肝脏卵圆细胞中细胞周期调控蛋白表达水平的影响,探讨HBX促进肝脏卵圆细胞增殖的分子基础。方法:稳定表达HBX基因的肝脏卵圆细胞克隆为实验组,表达绿色荧光蛋白的空载体组和LE/6卵圆细胞为对照组。Western blot检测细胞周期调控蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4、p21、p27的表达水平结果:与对照组相比,cyclinD1的蛋白表达水平在HBX-EGFP-LE/6细胞中显著上调,p27蛋白的表达轻微下调。结论:HBX在肝脏卵圆细胞中影响细胞周期相关基因的蛋白表达水平,可能是其促进肝脏卵圆细胞增殖的分子基础之一。第三节HBX对肝卵圆细胞MAPK信号及AKT信号的影响目的:研究HBX在卵圆细胞LE/6中对MAPK通路信号的影响,探讨HBX促进LE/6卵圆细胞增殖的分子机制。方法:稳定表达HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝脏卵圆细胞为实验组,表达绿色荧光蛋白的空载体组和LE/6卵圆细胞为对照组;Western blot检测了ERK、AKT、JNK、p38、p-ERK、pAKT、p-JNK、p-p38在对照组与实验组卵圆细胞内的表达水平。结果:与对照组比较,在HBX-EGFP-LE/6中,p-ERk、p-Akt的表达水平升高。但ERK、Akt、JNK、p38、p-p38、p-JNK在三种细胞中的蛋白表达水平没有明显变化。结论:胞内稳定表达的HBX蛋白可以在体外培养的肝脏卵圆细胞中上调ERK、AKT信号。第四节HBX上调cyclinD1表达并促进肝脏卵圆细胞增殖依赖于HBX上调的ERK及AKT信号目的:研究HBX促进卵圆细胞增殖及上调cyclinD1是否依赖于HBX-EGFP-LE/6内上调的ERK和/或AKT信号方法:稳定表达HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝脏卵圆细胞为实验组,表达绿色荧光蛋白的空载体组和LE/6卵圆细胞为对照组;运用特异性信号通路抑制剂LY294002,PD184352阻断卵圆细胞MEK/ERK及PI-3K/Akt信号转导,然后在指定时间点western blot检测cyclinD1在各组细胞中的表达情况; MTT检测阻断干预72h后各组细胞的增殖活性。结果:抑制剂PD184352阻断通路72h后,干预组HBX-EGFP-LE/6细胞较未干预组细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(p0.01)。抑制剂PD184352阻断通路72h后,干预组HBX-EGFP-LE/6细胞较未干预组细胞增殖活性降低,差异有统计学意义(p0.01)。HBX-EGFP-LE/6细胞中的CyclinD1蛋白高表达水平在两种抑制剂分别作用后均不能维持。结论: HBX上调的卵圆细胞增殖活性和CyclinD1表达水平,依赖于HBX上调的ERK及AKT信号。第一节HBX降低肝脏卵圆细胞对TGFβ1增殖抑制效应敏感性目的:研究卵圆细胞中HBX蛋白对TGFβ1增殖抑制效应的影响。方法: HBX-EGFP-LE/6卵圆细胞作为实验组, LE/6和EGFP-LE/6卵圆细胞作为对照组。运用Real-time和estern blot检测三组卵圆细胞中TGFβ受体2 mRNA及蛋白表达水平。MTT试验比较外源性TGFβ1在三组卵圆细胞中的增殖抑制效应。结果: TGFβ受体2在HBX- EGFP-LE/6中的m RNA及蛋白表达水平均下调。MTT表明外源性TGFβ1在对照组细胞中具有更强的增殖抑制效应,差异有统计学意义(p0.01)。结论:HBX影响卵圆细胞对TGFβ1增殖抑制效应的敏感度,可能与TGFβ受体2的基因表达水平下调有关。目的:研究乙型肝炎病毒编码X蛋白HBX对肝脏卵圆细胞中TGFβ/smad中核心元件samd2、samd3、samd4表达的调控作用。方法:稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6作为实验组,转染绿色荧光蛋白标记空载体的大鼠卵圆细胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圆细胞株LE/6作为对照组检测TGFβ/smad信号通路中的核心元件smad2、smad3、samd4的表达情况。Real-time PCR检测转染细胞系HBX-EGFP-LE/6,以及对照组EGFP-LE/6,LE/6中smad2、smad3、smad4的mRNA表达水平,western blot检测三组细胞中smad2、smad3、smad4蛋白表达情况。结果:与对照组相比,稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6中smad2的mRNA及蛋白表达水平未有显著变化。smad3、smad4的mRNA表达水平有显著降低(p0.05),Smad3蛋白表达水平有一定程度降低,smad4蛋白表达水平没有显著变化。结论:乙型肝炎病毒编码X蛋白可以在卵圆细胞中影响TGFβ/smad信号通路中的核心元件smad3的转录及蛋白合成,对samd4的转录有一定影响,对smad2的表达没有显著作用。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

细胞图,阳性对照,细胞,强度不等

细胞为阳性对照。其中 4、17、19 号克隆高表达 HBX 基因E/6 细胞中无 HBX 表达。观察 HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 细胞中绿色荧光蛋白表达/6、EGFP-LE/6 不同细胞克隆中均可见强度不等的绿色荧光。1 、E2 各组细胞绿色荧光阳性率＞95％。

细胞图,荧光显微镜观察,卵圆细胞,融合蛋白

图 1 HBX-L02 细胞为阳性对照。其中 4、17、19 号克隆高表达 HBX 基因。对照EGFP-LE/6、LE/6 细胞中无 HBX 表达。2、荧光显微镜观察 HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 细胞中绿色荧光蛋白表达情况。HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 不同细胞克隆中均可见强度不等的绿色荧光。其中 XX17、X19、E1 、E2 各组细胞绿色荧光阳性率＞95％。

卵圆细胞,培养液

表一 MTT 检测六组卵圆细胞增殖活性（mean±SD,n=6）h LE/6 E1 E2 X4 X17 X1912 0.25±0.03 0.23±0.03 0.25±0.02 0.25±0.02 0.24±0.02 0.23±0.0224 0.25±0.04 0.25±0.03 0.24±0.03 0.29±0.03 0.29±0.03 0.29±0.0348 0.44±0.04 0.43±0.05 0.44±0.09 0.58±0.06 0.56±0.07 0.58±0.0672 0.64±0.07 0.63±0.08 0.63±0.05 1.02±0.09 1.00±0.11 0.99±0.19

【共引文献】