RGD依赖的整合素信号通路与肝星状细胞增殖、凋亡及丹参单体干预研究

发布时间：2020-10-09 18:46

　　肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种致病因子引起慢性肝病，进而发展为肝硬化的一个动态过程与共同病理途径。其主要病理改变是细胞外间质(extracellular matrix，ECM)的过度合成与异常沉积，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)是参与该过程的最重要细胞，它的激活导致自身增殖和胶原合成增加，而肝纤维化恢复期HSCs凋亡明显增多。所以，HSCs增殖和凋亡在肝纤维化的形成和逆转过程中起关键作用，被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。 HSCs与ECM之间存在着复杂的相互作用，其相互作用主要经整合素(integrin)介导。基础研究表明，整合素与其相应配基结合后，多个粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)分子聚集在粘着斑(focaladhesion plaque，FAP)处，使FAK N-端区的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后可能激活多条信号途径，其中比较清楚的是RAS依赖的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)途径。细胞外信号调节激酶_(1／2)(extracellular signal-regulated kinase_1(／2)，ERK_(1／2))是MAPK家族中研究得最为清楚的成员，其通路RAS-RAF-MEK-ERK参与细胞多种功能活动。迄今为止，ECM成分如纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)及整合素在纤维化肝组织与HSCs中的表达及作用已有报道，但整合素活化后的胞内信号途径则知之甚少。为此，我们从HSCs与ECM之间的相互作用着手，以FAK、ERK_(1／2)为切入点，有机结合整体和离体试验，研究整合素信号通路在肝纤维化及HSCs增殖、凋亡中的作用。实验内容主要包括以下四部分：第一部分，FAK、ERK_1在大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达与肝星状细胞增殖，凋亡中文摘要目的：探讨FAK、ERK；及其wA在实验性大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达及与肝星状细胞增殖、凋亡的关系。方法：采用胆总管结扎Oile duct ligation，BDL）大鼠肝纤维化模型，将 80只雄性 Spr卿e Dawlcy大鼠随机分成假手术组与模型组。模型组分别于结扎后Zhr、6hr、Zd、lwk、ZWk、3Wb、4Wb麻醉动物，假手术组与4Wb模型组同批麻醉。采用HE染色、Masson三色染色确定模型建立情况；免疫组织化学及 RTPCR方法研究 F咂、E皿；及其 InRNA 在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化；应用免疫组织化学方法测定aSMA表达；采用TUNEL及。石MA免疫组织化学双重染色方法了解HSCS凋亡情况。结果：①随着肝纤维化发展，大鼠肝脏中a石MA阳性细胞明显增多，主要分布于汇管区、纤维间隔、肝窦周围及增生的胆管周围细胞，造模l～4wb大鼠肝组织a习MA的阳性面积（ 2．88％士2石3％，22石5％士2．16o，27．45O士l．86％，35．25％士2．34％）均显著高于正常组（5．88％士 l．46％），P＜0．of。②正常肝组织凋亡 HSC siB少，随肝纤维化程度加重，凋亡HSCS也增多。③纤维化肝组织中F肌、E皿；阳性细胞明显增多，主要分布于汇管区、纤维间隔及增生的胆管周围，血管内皮细胞、肝窦周围细胞中也有分布。ERK；在肝细胞也有表达。H者均与 a－S帆呈显著正相关，厂值分别为0．963、0．958，P＜0．05。④正常大鼠肝组织中有FAK、ERK；基因表达，分别于造模Zd、6hr开始上调，造模4Wb表达最多。结论：肝纤维化形成过程中HSCs大量活化、增殖，凋亡的HSCS也增多，凋亡机制参与调节HSCs数量的动态平衡；肝纤维化形成过程中 FAK、ERKI及其mRNA表达明显增加，FAK、ERKI表达增加在HSCS 增殖及肝纤维化形成与发展中起一定作用。第二部分：槽甘－天冬丝氨臼四聊肝星状细胞增植、凋亡的影响目的：探讨精－甘－天冬－丝氨酸（RGDS）四肽对纤维粘连蛋白（ibronectin， FN）刺激的HSCs增殖、凋亡及凋亡执行者Caspase上表达的影响，为利用RGDS四肽调控HSCS增殖与凋亡提供实验理论依据。方法：应用体外HSCS培养技术，采用h－胸腺嗜陡核昔（怕1dR）掺入法测定HSCs增殖；膜联蛋白（AnnexinN）／碘化丙陡瞩I）双标记流式细胞 2 中文摘要术团ow cytom呐，FCM卜 TU’NEL、扫描电镜及透射电镜等方法测定 HSCS凋亡；采用甲苯胺兰染色方法测定细胞粘附率；应用流式细胞方法测定Caspase习蛋白表达。结果：①RGDS四肽 25pg·InL”‘、50pg·InL”‘、100ng·InL”’组对 HSCS ’H－TdR掺入结果与对照组、FN组相比，均显著下降，Pwto．of，掺人抑制率分别是16．55％、50．23％、65．33％；100ng·InL”‘浓度组作用 12hr、 24h、48h的掺入抑制率分别是62．73o、74．23o、80．22o。巨RGDS 四肽对HSCs增殖有显著抑制效应，并呈剂量、时间依赖关系。RGES 四肽对 HSCS’H丁皿掺入无抑制作用。②RGDS四肋对 HSCS凋亡的诱导作用亦呈剂量和时间依赖关系：Annexin－Vrpl法检测，RGDS四肽干预 48hr后各组凋亡率分别为 9．49O左7．67
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R575.2
【文章目录】：
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英文缩写
研究论文 RGD依赖的整合素信号通路与肝星状细胞增殖、凋亡及丹参单体干预研究
    引言
    第一部分 FAK、ERK1在胆总管结扎大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达与肝星状细胞增殖、凋亡
        前言
        材料与方法
        结果
        讨论
        小结
        参考文献
        附图、附表
    第二部分 RGDS四肽对肝星状细胞增殖、凋亡的影响
        前言
        材料与方法
        结果
        讨论
        小结
        参考文献
        附图、附表
    第三部分 RGDS四肽抑制肝星状细胞活化的信号转导机制
        前言
        材料与方法
        结果
        讨论
        小结
        参考文献
        附图、附表
    第四部分丹参单体IH764-3对肝星状细胞增殖、凋亡干预研究
        1 肝硬化患者及胆总管结扎大鼠脂质过氧化水平测定
            前言
            材料与方法
            结果
            讨论
            小结
            参考文献
            附图、附表
        2 丹参单体IH764-3通过抑制脂质过氧化逆转肝星状细胞活化
            前言
            材料与方法
            结果
            讨论
            小结
            参考文献
            附图、附表
2O₂诱导肝星状细胞活化信号转导的影响'>        3 丹参单体对H₂O₂诱导肝星状细胞活化信号转导的影响
            前言
            材料与方法
            结果
            讨论
            小结
            参考文献
            附图、附表
    结语
综述一整合素信号转导通路与肝星状细胞行为
综述二氧化应激与肝纤维化
致谢
个人简历

【引证文献】