SIRT-6通过上调PPAR-α及阻遏肝细胞衰老改善非酒精性脂肪性肝病

发布时间：2020-10-10 22:27

　　 目的:研究沉默信息调节蛋白(Sirtuin)家族成员之一SIRT-6是否可以通过调控脂质代谢及肝细胞衰老过程以改善非酒精性脂肪性肝病,并探讨其具体的分子机制。方法:(1)体内实验。雄性C57BL/6J小鼠随机分为如下几组:4周普通饮食组(4w CD,n=5)、22周普通饮食组(22w CD,n=10)、22周高脂饮食组(22w HF,n=22)、22周高脂饮食合并SIRT-6过表达组及阴性对照组(末两周尾静脉注射SIRT-6过表达慢病毒及阴性对照病毒,分别命名22w HF+LV Sirt6、22w HF+LV NC,各n=4)。取各组肝组织进行HE染色、油红O染色等分析。RT-PCR检测各组SIRT-6、脂肪酸b氧化指标PPAR-a、脂质合成指标(PPAR-g、SCD-1)、衰老相关分泌表型指标(IL-6、CCL-8、HGF)、衰老指示物GLB-1及细胞周期指示物(MCM-2、P21)的m RNA表达。心脏取血,通过全自动生化分析仪检测各组血清AST、ALT含量。(2)体外实验。采用小鼠肝细胞系AML-12研究。向AML-12细胞分别转染SIRT-6过表达慢病毒及其阴性对照病毒、SIRT-6干扰质粒及其阴性对照质粒,在300m(44)PA或常规条件下培养24h。油红O染色检测各组脂滴沉积情况;用RT-PCR、Western blot或免疫荧光检测各组细胞SIRT-6、PPAR-a、PPAR-g、SCD-1、ACADM、CPT1a、IL-6、CCL-8、HGF、GLB-1、MCM-2、P21、g-H2AX的表达。(3)探讨SIRT-6上调PPAR-a的分子机制。(1)分别用SIRT-6去乙酰化酶高效激活剂花青素100m(44)、高效抑制剂儿茶素10m(44)干预常规培养或300m(44)PA培养条件下的AML-12细胞24h,Western blot检测各组PPAR-a的表达情况。(2)应用荧光素酶报告基因法检测常规培养及300m(44)PA培养条件下SIRT-6对PPAR-a启动子活性的调控作用,计算各组标准化相对荧光素酶活性倍数。结果:(1)体内实验:(1)HE及油红O染色提示22w HF组小鼠肝组织出现明显的大泡脂滴沉积,而22w HF+LV Sirt6组脂滴沉积显著减少;(2)RT-PCR提示4w CD、22w CD、22w HF组肝组织SIRT-6、MCM-2表达逐级下调(P0.05),IL-6、CCL-8、HGF、P21表达均逐级上调;相较于22w CD组,22w HF组PPAR-?表达下调,PPAR-?、SCD-1表达均上调(P0.05);与22w HF+LV NC组相比,22w HF+LV Sirt6组肝组织IL-6、CCL-8、HGF、GLB-1、P21表达均下调,PPAR-?表达上调(P0.05),PPAR-?、SCD-1表达无明显变化。(3)22w HF组小鼠血清AST、ALT水平显著升高(P0.05),而22w HF+LV Sirt6组AST、ALT水平与之相比下降(P0.05)。(2)体外实验:(1)油红O染色提示PA干预组细胞有明显脂滴沉积。当SIRT-6过表达时,脂滴沉积减轻。(2)RT-PCR、Western blot或免疫荧光提示PA干预组SIRT-6、PPAR-?、ACADM、CPT1a、MCM-2表达下调,PPAR-?、SCD-1、IL-6、CCL-8、HGF、GLB-1、P21、?-H2AX表达上调;与之相比当SIRT-6过表达时,除了PPAR-?、SCD-1,其他指标均逆转(P0.05);当SIRT-6沉默时,GLB-1表达上调(P0.05),PPAR-?、ACADM、CPT1a表达下调(P0.05)。(3)SIRT-6对PPAR-?的调控机制:(1)Western blot提示常规培养条件下花青素和儿茶素对PPAR-?的表达无影响;而在PA干预培养条件下两者可分别使PPAR-?的表达下调、上调(P0.05)。(2)荧光素酶报告基因实验提示在常规培养条件或PA干预培养条件下,SIRT-6的上调均可显著提高PPAR-?的启动子活性(P0.05)。结论:(1)SIRT-6改善脂质代谢紊乱的主要靶点是通过上调PPAR-?信号通路的表达促进脂肪酸?氧化;(2)SIRT-6主要通过增强PPAR-?启动子活性上调其通路表达;(3)SIRT-6具有同时调控脂质代谢和阻遏肝细胞衰老的作用,是NAFLD介导肝细胞衰老的关键调节因子。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575.5
【部分图文】：

. 用免疫组织化学法比较健康对照和慢性肝病病人肝组织 SIRT-6 的表达情况首先，我们从临床角度出发，通过免疫组织化学法，比较经病理学证实的健康对者、自身免疫性肝病病人、NAFLD 病人肝组织的 SIRT-6 的表达情况，以初步了解AFLD 与 SIRT-6 表达的关系。SIRT-6 定位于细胞核，故为核染。健康对照者肝细胞态正常，未见脂质沉积与炎性细胞浸润，SIRT-6 核染明显，提示 SIRT-6 表达量较（见图 1-A）；自身免疫性肝病病人肝组织未见脂质沉积，有明显的淋巴细胞和浆胞浸润，SIRT-6 核染轻度减低，提示 SIRT-6 表达量开始下降（见图 1-B）；NAFLD人肝细胞出现明显的脂质沉积，以大泡性脂肪滴变为主，伴慢性炎性细胞浸润。IRT-6 未见核染，提示 SIRT-6 表达处于更低水平（见图 1-C）。上述实验结果为论证IRT-6 参与 NAFLD 发生发展提供了临床基础，下一步我们将通过基础实验进一步分 SIRT-6 调控 NAFLD 脂质代谢紊乱与肝细胞衰老的机制。此外，本节实验结果提示IRT-6 还可能参与到更多慢性肝病，如自身免疫性肝病的发生发展之中。

图 2 小鼠喂养周期体重变化趋势与大体形态与 HF 组小鼠在喂养第 0w、5w、10w、15w、20w 时的体重及变化趋势两组小鼠体重的差异具有统计学意义，P<0.05D、22w HF、22w HF+LV-NC、22w HF+LV-Sirt6 四组小鼠的大体形态（标好的实验方案，普通饮食组小鼠（CD 组）和高脂饮食喂养 20 周。喂养第 0w、5w、10w、15w、20w 时 CD 2.12 1.98）g、（25.65 4.94）g、（28.33 4.06）g、（6）g；HF 组小鼠的体重分别为：（23.11 2.38）g、（20）g、（36.78 3.72）g、（37.91 4.77）g。第 15w、统计学意义。两组小鼠体重变化趋势如图 2-A 所示。，从HF组随机选取8只小鼠，尾静脉注射慢病毒。其中4NC。上述各组按照之前的方法继续喂养 2 周直至第 22 22w HF、22w HF+LV-NC、22w HF+LV-Sirt6 四组小鼠。

两种检测方法均提示 4w CD 组、22w CD 组小鼠的肝组织未见明显的脂质沉积（见图3-A、-B，图 4-A、-B）。而 22w HF 组小鼠的肝组织可见到明显的脂质沉积，超过60%的肝细胞出现大泡性脂滴，提示严重脂肪变性（见图 3-C、图 4-C）。22w HF+LV-Sirt6组小鼠的肝组织脂质沉积显著减少，肝细胞脂肪变性得到明显改善（见图 3-D、图4-D）。本节实验结果提示 SIRT-6 可以减轻 NAFLD 小鼠的脂质沉积。图 3 各组小鼠肝组织 HE 染色（×400）A、B、C、D 分别表示 4w CD、22w CD、22w HF、22w HF+LV-Sirt6 四组小鼠肝组织的 HE 染色图 4 各组小鼠肝组织油红 O 染色（×400）A、B、C、D 分别表示 4w CD、22w CD、22w HF、22w HF+LV-Sirt6 四组小鼠肝组织的油红 O 染色4. 各组小鼠肝组织免疫组织化学染色用免疫组织化学的方法检测各组小鼠肝组织内 SIRT-6、 -H2AX 的表达（见图 5）。SIRT-6 与 -H2AX 定位于细胞核，故均是核染。4w CD、22w CD、22w HF 三组小鼠肝组织内 SIRT-6 的表达逐渐减少，其中 22w HF 组下调最显著。相较于 22w HF 组，22w HF+LV-Sirt6 组肝组织内 SIRT-6 的表达明显上调。4w CD、22w CD、22w HF 三
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本文编号：2835669