肝纤维化(Liver fibrosis)主要由病毒感染、酒精中毒等多种因素引起的慢性肝损伤。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)参与肝纤维化的起始、进展和消退过程,静止的肝星状细胞(Q-HSCs)具有上皮细胞和脂肪细胞特征,其向肌成纤维细胞(MF-HSCs)的转分化是肝纤维化的关键环节,而上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)参与该环节。EMT是细胞失去上皮表型和基因表达特征,转变为间质细胞的过程。多数研究表明,在各器官中肌成纤维细胞是通过EMT产生,以应对各种慢性损伤,该过程在一定条件作用下可发生逆转。近年研究表明二甲双胍(metformin,Met)有广泛的药理作用,各种药理机制中包括抑制EMT过程。同时已有实验证明二甲双胍可在一定程度缓解肝纤维化,其可以通过作用HSCs到达逆转肝纤维化目的。因此,二甲双胍可能通过逆转EMT过程起到抑制肝纤维化的作用,进一步对肝纤维化逆转机制的认识,有望为肝纤维化治疗提供新的理论依据。目的研究二甲双胍对小鼠肝纤维化及其上皮间质转化相关蛋白表达的影响及二甲双胍是否通过调控上皮间质转化抑制肝星状细胞的活化方法1、将45只4周龄的小鼠随机分为3组,每组15只,即正常组、模型组(CCl_4组)、CCl_4+二甲双胍治疗组(CCl_4+Met组);模型组给予橄榄油、CCl_4混合物处理,按1:3比例,经腹腔注射,2次/周,剂量为0.4 ml/kg;正常组给予相同容量橄榄油,腹腔注射,2次/周,剂量为0.4 ml/kg;二甲双胍治疗组造模方法同模型组。从第3周开始,通过灌胃给予二甲双胍治疗,200 mg/次,1次/天;正常组和模型组通过灌胃给予生理盐水,200 mg/次,1次/天,至造模第6周处死小鼠,取肝脏组织。计算小鼠的肝脏指数,检测肝功能相关指标ALT、AST含量,进行HE和天狼猩红染色观察小鼠肝脏病理学改变。通过Western blot和RT-PCR检测肝纤维化相关蛋白α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)含量,EMT相关蛋白上皮标志物如E-cadherin;间质标记物如vimentin、N-cadherin、Twist的表达。通过Image J软件对蛋白表达量进行分析。2、将对数生长期的LX-2细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种于12个培养皿中,平均分为四组即空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+Met低剂量组、TGF-β1+Met高剂量组。空白对照组不做处理;TGF-β1组给予10ng/ml的细胞因子TGF-β1诱导细胞活化;TGF-β1+Met低剂量组给予10 ng/ml的细胞因子TGF-β1和5 mmol/ml的二甲双胍;TGF-β1+Met高剂量组给予10 ng/ml的细胞因子TGF-β1和10 mmol/ml的二甲双胍。通过油红O染色了解细胞状态,通过免疫荧光、克隆形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞活化、增殖、迁移能力,通过Western blot和RT-PCR检测细胞活化相关蛋白α-SMA的表达和EMT相关蛋白上皮标志物如E-cadherin;间质标记物如vimentin、N-cadherin及Twist的表达,并通过Image J软件对蛋白表达量进行分析。结果1、与正常组比较,CCl_4组肝脏指数明显升高,差异有统计学意义(p0.01);与CCl_4组比较,CCl_4+Met组肝脏指数一定程度降低,但高于正常组,差异显著,有统计学意义(p0.01)。CCl_4组小鼠的肝脏功能相关指标AST、ALT较正常组明显升高,差异有统计学意义(p0.01);与CCl_4组相比,CCl_4+Met组小鼠AST、ALT含量明显降低,差异有统计学意义(p0.01)。正常小鼠肝脏组织无明显变化;与正常组比较,CCl_4组小鼠汇管区内出现粗大的胶原纤维条索分割包绕,纤维间隔明显增厚,肝小叶结构明显异常,有假小叶形成,肝细胞索排列紊乱,间质内炎性细胞浸润明显,出现大量胶原沉积,分布广泛,在汇管区间分布较多,α-SMA和CollagenⅠ表达明显增高;与CCl_4组相比,CCl_4+Met治疗组,胶原纤维的增生减轻,假小叶的形成改善,炎性细胞浸润程度减轻,仅有部分胶原增生,肝小叶中可见少量间隔形成,α-SMA和CollagenⅠ表达减少。WB、RT-PCR结果显示:CCl_4组小鼠肝脏内α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达明显升高;与CCl_4组比较,CCl_4+Met组小鼠肝脏α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达显著减少。CCl_4组小鼠肝脏内上皮标志物E-cadherin表达明显减少,间质标志物vimentin、N-cadherin和Twist表达明显增多;与CCl_4组比较,CCl_4+Met组小鼠肝脏内E-cadherin表达明显增加,间质标志物vimentin、N-cadherin和Twist表达明显减少。2、与空白对照组比较,TGF-β1组细胞活化程度、增殖能力明显升高、迁移能力增加;给予Met干预后细胞增殖能力下降、迁移能力下降,有一定程度的浓度依赖性。WB和RT-PCR实验结果显示:与空白对照组比较,TGF-β1组α-SMA表达明显升高;Met干预后α-SMA表达减少,有一定程度的浓度依赖性。同时,空白对照组细胞内上皮标志物表达较多,间质标志物少量表达;与空白对照组比较,TGF-β1组上皮标志物E-cadherin表达明显减少,间质标志物vimentin、N-cadherin和Twist表达明显增多;Met干预后上皮标志物表达增加,间质标志物表达减少,有一定程度的浓度依赖性。结论(1)腹腔注射CCl_4后,肝功能指标升高,肝纤维化相关α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达明显升高,EMT相关蛋白表达升高;(2)二甲双胍可改善肝脏纤维化,使α-SMA和CollagenⅠ的表达明显下调;(3)二甲双胍改善肝纤维化病变程度的同时,抑制肝脏EMT相关蛋白的表达;(4)TGF-β1诱导HSCs的活化,同时促进细胞EMT相关蛋白表达;(5)二甲双胍可抑制活化HSCs的EMT相关蛋白表达,且呈浓度依赖性;(6)在二甲双胍作用下,HSCs的活化、增殖和迁移能力明显下降,且呈浓度依赖性。
【学位单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：
第一部分 二甲双胍对小鼠肝纤维化及其上皮间质转化相关蛋白表达的影响果指数及肝功能变化指数数的变化可间接反映出小鼠肝纤维化发生过程肝脏大体标验结果得出，与空白组比较，CCl4组肝脏指数明显升高，义（p<0.01）；与 CCl4组比较，CCl4+Met 组肝脏指数一组高，差异显著，有统计学意义（p<0.01）（图 1-1）。
图 1-2 血清中 ALT、AST 含量Figure 1-2 Contents of ALT and AST in serum4.2 各组小鼠肝脏组织病理染色及结果分析4.2.1 肝脏 HE 染色正常小鼠肝脏内肝小叶正常，肝细胞索整齐排列，间质内无炎性细胞与正常组比较，CCl4组小鼠汇管区内出现粗大的胶原纤维条索分割包绕，隔明显增厚，肝小叶结构明显异常，有假小叶形成，肝细胞索排列紊乱，炎性细胞浸润明显；与 CCl4组相比，CCl4+Met 治疗组，胶原纤维的增生减小叶的形成改善，炎性细胞浸润程度减轻（图 1-3）。
图 1-2 血清中 ALT、AST 含量Figure 1-2 Contents of ALT and AST in serum4.2 各组小鼠肝脏组织病理染色及结果分析4.2.1 肝脏 HE 染色正常小鼠肝脏内肝小叶正常，肝细胞索整齐排列，间质内无炎性细胞浸润；与正常组比较，CCl4组小鼠汇管区内出现粗大的胶原纤维条索分割包绕，纤维间隔明显增厚，肝小叶结构明显异常，有假小叶形成，肝细胞索排列紊乱，间质内炎性细胞浸润明显；与 CCl4组相比，CCl4+Met 治疗组，胶原纤维的增生减轻，假小叶的形成改善，炎性细胞浸润程度减轻（图 1-3）。
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本文编号：
2837318
