非酒精性脂肪性肝病诊治的初步研究

发布时间：2020-10-15 09:48

　　 第一部分上海地区离退休高级公务员非酒精性脂肪性肝病的队列研究【背景和目的】本研究通过对上海地区60周岁以上离退休高级公务员进行5年队列随访,研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在老年人群中的临床特征,发病危险因素及死亡原因。【方法】于2012年纳入在上海新华医院医院老年科的856名就诊者(男性697名,女性159名),完善病史及临床资料的收集,通过超声诊断NAFLD,并在此基础上进行5年随访。2017年6月对所有人群进行复测,对所有死亡病例进行死亡原因调查。根据此两组资料分析老年人中NAFLD的自然病程以及发病危险因素。【结果】NAFLD在大于60岁的老年人群中患病率为28.27%,在60-74岁人群中达到最高峰。5年随访期间共39人新确诊NAFLD,达6.35%。校正年龄、性别以及代谢综合征各组分后,BMI(22.5-25.0)仍是老年人中NAFLD发病的危险因素,相对危险度(95%置信区间)为1.393(1.201-1.581)。在BMI小于25.0的老年人中,血糖水平升高以及血压增高为其NAFLD发病的危险因素,相对危险度(95%置信区间)分别为1.446(1.209-1.779)和6.270(1.846-20.939)。NAFLD组全因死亡率为5.79%。5年随访期间NAFLD及非NAFLD组中心血管疾病发病率无显著差异(16.61%vs 19.83%,p=0.061),但NAFLD组心血管疾病相关死亡率显著高于非NAFLD组(36.59%vs 64.28%,p=0.037)。NAFLD的前三位死亡原因分别为:心血管疾病、肺部感染以及肝外恶性肿瘤。【结论】NAFLD发病高峰集中于60-75岁年龄段。BMI介于22.5-25kg/m~2是离退休高级公务员中NAFLD发病的危险因素,独立于血糖、血压等代谢综合征相关因素之外。尽管全因死亡率无显著差异,NAFLD组心血管疾病相关病死率显著增高,心血管疾病是NAFLD患者的首要死亡原因。第二部分非酒精性脂肪性肝病中外周血白细胞DNA甲基化位点的改变。【背景和目的】衰老使人体处于慢性炎症状态,可进一步加重表观遗传修饰紊乱。近年来老年人群中NAFLD患病率逐渐升高。除代谢因素外,表观遗传学改变也是导致NAFLD发病的因素之一。本研究的目的探讨DNA甲基化在NAFLD无创诊断中的应用价值。【方法】本研究纳入35名经肝穿刺检查确诊NAFLD的患者和30名正常对照组,取外周血DNA进行甲基化芯片检测。甲基化结果用β值表示,通过多因素分析检验甲基化与肝酶和血脂谱的相关性。存在显著相关性的甲基化位点进一步用于分析其与NAFLD组织学特征包括肝脏脂肪样变、肝细胞气球样变、小叶内炎症以及肝纤维化的相关性。【结果】通过肝活检确诊17例NASH,18例单纯性脂肪肝(NAFL)。NASH组、NAFL组白细胞DNA甲基化普遍呈低甲基化水平。甲基化芯片数据分析筛选出65个外周血甲基化位点与NAFLD相关,及119个与单纯性脂肪肝相关的位点。多因素分析发现42个位点与ALT水平相关,而32个位点与血脂水平相关。这些位点表现出与肝脂肪样变及小叶性炎症的强相关性。其中ACSL4,CTP1A,CRSL1,SIGIRR,SSBP1和ZNF622显示作为生物标志物诊断NASH良好诊断价值。其中SIGIRR和SSBP1的ROC曲线下面积分别达到0.882和0.817。【结论】循环中白细胞DNA甲基化芯片的检测显示其在NAFLD患者中普遍低甲基化改变为主,与肝酶、血脂谱以及NAFLD病理学特征呈显著相关性。ACSL4,CTP1A,CRSL1,SIGIRR,SSBP1和ZNF622可为NAFLD临床表型的分层提供帮助。第三部分GLP-1对ob/ob小鼠脂代谢及肝脏病理学变化的影响【背景和目的】衰老状态导致表观遗传修饰紊乱,前期研究表明NAFLD患者中DNA甲基化与肝脏小叶间炎症存在强相关性。胰血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)在减重、改善胰岛素抵抗及抗炎的作用正逐渐受到认识。本研究拟通过重组慢病毒靶向导入ob/ob小鼠体内,借助持续提高GLP-1的分泌,观察其对小鼠脂代谢、肝脏病理学变化的影响。【方法】50-55克的ob/ob小鼠40只,随机分配为四组:GLP-1组、空病毒(EV)组、高脂喂养(HFD)组和对照组。对照组给予普通饲料喂养,其余三组给予高脂饲料。饲养16周时对小鼠行PET/CT全身扫描。随后GLP-1组给予重组慢病毒LV-GLP-1注射,EV组注射空病毒对照,维持原饲养方法至24周,再次进行小鼠全身扫描,测量皮下脂肪及肝脏面积,行血清学检验并取肝脏标本进行组织学检查。【结果】GLP-1组ob/ob小鼠注射后血清GLP-1水平较其它三组均显著升高,达到6.00±1.42pmol/L。EV组、HFD组、对照组的GLP-1水平为5.28±1.18pmol/L,5.27±1.11pmol/L,及5.10±0.64pmol/L(与GLP-1组相比p均0.05)。GLP-1组ob/ob小鼠中,其L1-L2皮下脂肪组织体积在注射后明显降低(1228.69±237.58mm3 vs 857.10±101.54 mm3,p=0.020);甘油三酯水平在注射后降低,为0.61±0.14mmol/l,与EV组和HFD组相比存在显著差异(p=0.041和p=0.044),但肝脏甘油三酯含量为0.12±0.03 mmol/g prot,与对照组相比未见统计学差异。病理学检查中,GLP-1组ob/ob小鼠的肝细胞气球样变和小叶内炎症的平均评分最低,与对照组存在统计学差异(p=0.020以及p=0.010)。四组中脂肪样变及肝纤维化评分无显著差异。【结论】通过建立体内持续GLP-1分泌,可以显著减少ob/ob小鼠皮下脂肪体积,同时改善小鼠肝脏气球样变及小叶间炎症。但GLP-1水平增高未见使脂肪样变有所改善,且对肝纤维化作用未见明显差异。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575.5
【部分图文】：

本研究（图1）最终入组856例受试者，其中男性697人，女性159人，平均年龄79.05±11.29岁。图1. 研究人群Figure 1. Study Population.在基线时肝脏超声检查发现242人符合NAFLD诊断（28.27%）。其中男性232人，占总人数的27.10%。NAFLD患者平均年龄76.12±11.63岁，非NAFLD患者平均年龄为80.28±10.69岁（p=0.027）。NAFLD患者的体重、BMI均显著高于无NAFLD患者。在生化各项指标中，NAFLD组的各项肝酶水平均显著升高（AST,ALT, GGT, AKP, M-AST）；在血脂谱中，除了LDL-C以外，NAFLD患者也显示了

图2 NASH的诊断路径Figure2. The diagnostic path of NASH.1.5 统计所有资料先经正态分布检验，正态分布的计数资料和计量资料用均数±标准差，或者个数及百分比表示。使用 R 软件中的 IMA 包进行甲基化数据预处理，随后完善 t-test 检验。P 值通过 Benjamini and Hochberg 法计算错误发现率即 falsdiscovery rate (FDR) 进行校正。在这次的研究中，FDR 低于 5%被视作存在显著差异。使用多因素线性回归分析检验甲基化位点与肝酶、血脂谱的相关性，结果用性别、年龄及BMI进行校正。甲基化位点与各个组织学特点相关性使用Pearso相关系数检验。最后，经筛选后的甲基化位点进行 ROC 曲线分析。诊断效应通过曲线下面积（AUC）表示。所有统计分析均使用 SPSS 17.0 software，制图采用 Graphpad Prism 6.0(GraphPad, La Jolla, CA, USA)。Medcalc 15.8(MedcalSoftware bvba, Ostend, Belgium) 用于 ROC 检验。P 值低于 0.05 表示有统计学意

我们首先对 NAFLD 患者的整体基因组甲基化进行分析。在通过芯片探测的 418913 个位点中，我们发现 NASH 组、NAFL 组及正常对照组中CpG 位点甲基化水平都相接近，各组间均不存在显著差异。根据与基因位置的关系，甲基化位点分别位于 CpG 岛、N shore、N shelf 和 S shore、S shelf 区 5大部位（图 3A）。另外，根据功能分组，甲基化位点又分位于转录起始点(TSS)上游200bp和 1500bp 区域(TSS200 和TSS1500)，5 UTR 和第一外显子(1st Exon)区，gene body和 3 -UTR 区域（图3）。其中，转录起始点(TSS)上游200bp和1500bp区域(TSS200 和 TSS1500)，5 UTR 和第一外显子(1st Exon)区，定义为启动子区(promoter)。通过对各个部分的 β 值统计，无论是 NASH、NAFL 还是正常对照组，CpG 岛或启动子区的位点均整体呈低甲基化水平。
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本文编号：2842015