骨髓间充质干细胞在淋巴细胞参与下影响HBV复制的体外研究

发布时间：2020-10-16 10:57

　　 目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs)在体外淋巴细胞参与下对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响及其机制的初步研究。方法(1)选用体重80-100g BN大鼠,应用全骨髓培养/贴壁分离筛选法,分离、培养并扩增BM MSCs,应用流式细胞术对所培养的第3代细胞进行表面标记分子鉴定,并通过诱导培养分化为脂肪、成骨细胞,检测BM MSCs的分化能力。(2)细胞共培养:选取状态良好的第三代BM MSCs,提取BN大鼠新鲜的脾淋巴细胞,选择培养状态良好的Hep G 2.2.15细胞,采用Transwell小室做细胞共培养。实验分组:共5组,第1组为单纯脾淋巴细胞组;第2组为单纯Hep G 2.2.15细胞组;第3组为BM MSCs+Hep G2.2.15细胞组;第4组为脾淋巴细胞+Hep G2.2.15细胞组;第5组为脾淋巴细胞+BM MSCs+Hep G 2.2.15细胞组。(3)在共培养24 h、48 h及72 h后,采用MTT法对脾淋巴细胞及贴壁细胞进行细胞活性检测,实时定量PCR测定上清液中HBV DNA水平、Hep G 2.2.15细胞内HBV ccc DNA水平及BM MSCs中的HBV ccc DNA水平,流式细胞术对T淋巴细胞亚群的比例变化进行检测,应用ELISA法检测上清液中细胞因子IFN-γ、IL-10水平。结果(1)BM MSCs鉴定:在体外成功提取并扩增BM MSCs,对所提取的细胞进行鉴定,其具备典型的MSCs的形态特点,培养到第3代细胞进行表面标记分子学鉴定,结果显示:CD29、CD90、RT1A表达的阳性率分别为97.0%、96.3%和96.3%,而CD34、CD45、RT1B阴性率均95%,且经诱导培养分化后,所提细胞经诱导培养能够成功分化为成骨细胞(经由von kossa染色后在显微镜下可以观察到黑色钙盐沉积)及脂肪细胞(经由油红O染色后显微镜下可观察到细胞胞浆内呈红色脂滴)。(2)检测BM MSCs对HBV复制的影响:在体外细胞培养的环境下HBV DNA及HBV ccc DNA在24 h、48 h及72 h时,与第2、3和4组比较,第5组HBV DNA的表达水平明显降低,且在48h时差异显著,HBV DNA:(181.000±14.731)IU/m L vs(6270.000±300.450)IU/m L、(2564.000±231.058)IU/m L、(2433.300±302.379)IU/m L;HBV ccc DNA:(4.330×105±0.464×105)IU/m L vs(11.100×105±0.375×105)IU/m L、(8.930×105±0.778×105)IU/m L、(9.850×105±0.810×105)IU/m L,P0.01;各组BM MSCs中均未检测出HBV ccc DNA的复制。(3)BM MSCs对HBV复制影响机制:细胞因子检测结果,上清中淋巴细胞及BM MSCs分泌IFN-γ的水平与HBV DNA水平呈负相关(淋巴细胞24 h:r=-0.900;48 h:r=-0.982;72 h:r=-0.968,P0.05。BM MSCs 24 h:r=-0.828;48 h:r=-0.922;72 h,r=-0.828,P0.05),而IL-10水平与HBV DNA水平呈正相关(24 h:r=0.860,48 h:r=0.972,P0.05)。T细胞亚群检测,结果显示CD4+/CD8+比例有所升高,且经相关性分析,共培养后淋巴细胞表面标志CD8+细胞的百分率与HBV DNA水平呈正相关(24 h:r=0.865,48 h:r=0.766,72 h:r=0.912,P0.05)。结论成功从BN大鼠股骨、胫骨中提取BM MSCs,并于体外培养,通过细胞形态、细胞表面分子标记以及诱导分化能力这三方面进行验证,符合BM MSCs的典型特征,在淋巴细胞参与下可以抑制HBV DNA的表达;影响HBV的复制,可能的影响机制是BM MSCs通过自身分泌IFN-γ等细胞因子,及通过调节Tc1/Tc2平衡等方式实现的。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

von Kossa试剂盒在诱导12-14 d后进行染色，如在显微镜下能够观察到细胞中有黑色的钙盐沉积则为阳性。1.2 结果1.2.1 BM MSCs 典型形态细胞形态学：提取、分离后刚接种在培养瓶内的细胞在显微镜下观察呈圆形小亮点，形态大小均一、胞体透亮。48 h后观察可见大部分细胞散在分布并贴壁生长，细胞形态以圆形为主，部分可见已伸展出伪足。随着细胞培养液的更换，贴壁细胞逐渐分裂增殖、体积增大，形成多角形、梭形、椭圆形或纺锤形。培养7-8 d后出现明显细胞集落，铺满培养瓶底大于80%，此时即可进行第1次传代。随后根据细胞生长情况约每3-4 d即可进行下一次传代。杂质细胞会随每一次细胞传代和换液逐渐越少，使细胞得以纯化，逐渐变为绝大部分为细长梭形且排列整齐、形态均一的细胞（图1）。

对所获细胞继续进行了表面标记分子表达率的检测。结果显示第 3 代 BN 大鼠BM MSCs 表达 CD29、CD90、RT1A 的阳性率分别为 97.0%、96.3%和 96.3%；而 CD34、CD45、RT1B 的阴性率均>95%（图 2），这样的结果符合 BM MSCs表面标记分子的特征，即可证实我们所提取、培养的细胞是 BM MSCs。

图 2. 大鼠 BM MSCs 表面标记鉴定A：CD29 CD34 的表达 B：CD45 CD90 的表达 C：RT1A RT1B 的表达1.2.3 BM MSCs 体外诱导分化能力检测BM MSC 具备向多种组织及细胞的定向分化能力，给予特定培养条件，可将其诱导分化为脂肪和成骨细胞。所获细胞经成脂诱导分化液培养 8-10 d 后，油红 O 染液染色镜下观察示：与未经诱导分化的细胞（图 3-A）相比，其胞浆中可见多个被染成橘红色的脂滴（图 3-B），表明所获细胞具备分化成为脂肪细胞的能力。同样，细胞经成骨细胞诱导分化液培养约 14 d 后，von Kossa 法染色显微镜下示：细胞可见被染成黑色的钙盐沉积物（图 3-C），表明其具备分化为成骨细胞的能力。
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本文编号：2843162