慢性束缚应激诱导PAR-2和TRPV-1异常表达在食管氧化应激及炎症发生的作用研究

发布时间：2020-10-17 04:17

　　 目的:建立小鼠慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS)模型,分析实验组与对照组小鼠食管黏膜的变化和局部蛋白酶活化受体2(protei nase-activated receptor-2,PAR-2)、瞬时电位香草酸亚型 1(transient receptor potential vanilloid-1,TRPV-1)及活性氧自由基(ROS)的表达水平及意义,探讨心理应激在胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)食管高敏感性及食管炎症发生中的作用,以及氧化应激所产生的影响。方法:20只雄性无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)昆明小鼠随机分2组,即慢性束缚应激组(CRS)和正常对照组(normal control,NC)。CRS组小鼠每天在自制式束缚器中限制活动2h,其余时间两组小鼠在相同环境中自由饮水摄食,实验持续14天。通过HE染色在光学显微镜下观察食管组织病理学改变并进行组织损伤评分。采用免疫组化方法检测PAR-2,TRPV-1及还原型烟酰胺腺嗓吟二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NADPH oxidase 4,NOX-4)在小鼠食管中的表达,进一步通过蛋白质印迹法检测PAR-2,TRPV-1蛋白表达量,并采用逆转录PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法检测食管组织中 PAR-2、TRPV-1、氧化蛋白、抗氧化蛋白及相关炎症因子微RNA的表达量。结果:与NC组小鼠相比,CRS组小鼠体重增加量低于NC组,差异有统计学意义(P0.001)。HE染色镜下观察可见:CRS组小鼠食管黏膜可见上皮层增生,中性粒细胞及浆细胞浸润等炎症性改变,NC组未见明显异常;此外CRS组小鼠上皮细胞损伤及黏膜下炎症细胞评分均高于NC组,两组差异有统计学意义(均P0.05);NC组与CRS组黏膜下水肿评分差异无统计学意义(P0.05)。免疫组化结果显示,PAR-2和TRPV-1阳性着色细胞在大部分标本中均可见到,但CRS组小鼠组织中阳性着色较NC组染色深且丰富。蛋白质印迹法检测结果表明,CRS组食管标本中PAR-2和TRPV-1蛋白质表达量显著高于NC组,差异有统计学意义(均P0.001)。实时定量RT-PCR实验结果表明,CRS组PAR-2,TRPV-1和氧化蛋白NOX-4 mRNA表达水平高于NC组,差异有统计学意义(均P0.001);与NC组比较,CRS组抗氧化蛋白锰超氧化物歧化酶(Mn-Superoxide dismutase,Mn-SOD)和铜锌超氧化物歧化酶(Cu Zn-SOD)mRNA表达水平明显高于NC组,差异有统计学意义(均P0.05);CRS组炎症相关因子,如白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素8(IL-8)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达水平较NC组显著上调,差异有统计学意义(均P0.001)。结论:(1)PAR-2、TRPV-1受体在慢性束缚应激小鼠食管中过度表达,提示慢性束缚应激引起食管高敏感性的产生;(2)慢性束缚应激小鼠食管ROS(Nox-4)及抗氧化酶(Mn-SOD、CuZn-SOD)异常表达,提示慢性束缚应激诱导食管ROS过量产生,并引起食管氧化、抗氧化防御系统紊乱,导致氧化应激的产生;(3)心理应激诱导的氧化应激的发生可能参与食管高敏感性的产生。
【学位单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R571
【部分图文】：

ａｎｄ?ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ?ｓｔａｔｅ?ｉｎ?ａ?ｍｕｒｉｎｅ?ｍｏｄｅｌ．?Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．?２０１６；７３：１８６－９５．）?〇??自制式束缚器是采用５０ｍｌ离心管用烧红的探针将针筒的前壁及侧壁布满小孔（孔径：??２－３ｍｍ，图１），以减少塑料管内温度升高、保证使小鼠正常呼吸，并每五个束缚器??固定于平整的泡沫板上。到规定的束缚时间后应激组小鼠放置于束缚器，关闭离心??管口限制其活动，实验持续１４天。实验期间每７ｄ更换垫料１次，实验一开始给予??足量水（４００ｍＬ）及饲料（１５０ｇ），之后每２天一次进行体重、饮水、饮食量。对照??组除不进行束缚以外，其它处理都相同（图２）。??■?＿５??图１自制式束缚器??Ｆｉｇ．２?Ｈｏｍｅ－ｍａｄｅ?ｒｅｓｔｒａｉｎｔ?ｄｅｖｉｓｅ??ａ?口涵醒??图２造模过程??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｕｒｉｎｅ?ｍｏｄｅｌ??２．２．３造模成功评价??在慢性束缚应激的１４天下午开始对各组小鼠禁食水。束缚应激结束后，于第１５??天对各组小鼠进行深度麻醉（１０％水合氯醛，０．１ｍｌ／２０ｇ，?ｉ．ｐ．），采取平卧位固定，??腹部取正中切口约３ｃｍ，下腔静脉取血，取静脉血约１．５ｍｌ置于２ｍｌＥＰ管内。血浆??样品在取材后立刻以３５００ｒｐｍ的速度低温离心５分钟、留取上层血清、－８０°Ｃ保存

管口限制其活动，实验持续１４天。实验期间每７ｄ更换垫料１次，实验一开始给予??足量水（４００ｍＬ）及饲料（１５０ｇ），之后每２天一次进行体重、饮水、饮食量。对照??组除不进行束缚以外，其它处理都相同（图２）。??■?＿５??图１自制式束缚器??Ｆｉｇ．２?Ｈｏｍｅ－ｍａｄｅ?ｒｅｓｔｒａｉｎｔ?ｄｅｖｉｓｅ??ａ?口涵醒??图２造模过程??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｍｕｒｉｎｅ?ｍｏｄｅｌ??２．２．３造模成功评价??在慢性束缚应激的１４天下午开始对各组小鼠禁食水。束缚应激结束后，于第１５??天对各组小鼠进行深度麻醉（１０％水合氯醛，０．１ｍｌ／２０ｇ，?ｉ．ｐ．），采取平卧位固定，??腹部取正中切口约３ｃｍ，下腔静脉取血，取静脉血约１．５ｍｌ置于２ｍｌＥＰ管内。血浆??样品在取材后立刻以３５００ｒｐｍ的速度低温离心５分钟、留取上层血清、－８０°Ｃ保存，??并且分两份使用。一份用于后续ＥＬＩＳＡ检测ＡＣＴＨ?（促肾上腺皮质激素）、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ??９??

图３技术路线图??Ｆｉｇ．３?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏａｄｍａｐ??
【参考文献】

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本文编号：2844260