脯氨酰内肽酶在小鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用初探

发布时间：2020-10-23 08:20

　　 背景与目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征在肝脏的表现,其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关的肝硬化和肝细胞癌。在我国,该病已成为最主要的慢性肝脏疾病之一,约占我国肝脏疾病比例的49.3%。虽然目前已经认识到饮食习惯改变、环境和遗传因素等共同导致的胰岛素抵抗、肥胖和肠道菌群改变等是NAFLD的发病基础,但NAFLD特别是NASH的发病机制仍有待深入阐明。脯氨酰内肽酶(PREP)是一种由约700个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶,能特异性水解含不多于30~40个氨基酸的肽链中的脯氨酸残基。有研究表明,PREP与胰岛素释放、摄食行为、器官炎症性疾病、炎症细胞因子代谢和肝再生等密切相关。前期体外研究发现PREP可抑制游离脂肪酸诱导的肝细胞脂肪变,然而,目前尚未见PREP参与NAFLD发病的体内研究报道。为此,本研究采用高脂高胆固醇饮食建立小鼠NAFLD模型,结合PREP特异性抑制剂KYP-2047,观察PREP在NAFLD进展中的动态变化和对疾病发展的影响。方法:雄性野生型C57BL/6J小鼠分成两部分实验。第一部分将小鼠随机分成对照组和模型组,分别给予高脂高胆固醇饲料和标准饲料饲养4w、8w、12w和16w。第二部分将小鼠随机分为对照组、模型组和干预组。对照组饲以标准饲料,模型组和干预组持续饲以高脂高胆固醇饲料,饲养10周后,干预组予以皮下植入胶囊渗透泵持续稳定注射PREP特异性抑制剂KYP-2047,剂量为5mg/kg(体质量)/d,对照组和模型组相应注射等量生理盐水,持续干预6周。实验结束后处死小鼠,收集血清和肝组织等保存待检测。采用自动生化仪测定血清生化指标;采用酶联免疫吸附测定法测定血清空腹胰岛素水平;采用Suc-Gly-Pro-AMC底物法检测肝组织和血清中PREP活性;采用苏木素-伊红染色及Masson染色观察肝脏病理学改变,并计算NAFLD活动度积分(NAS);采用荧光定量PCR法、Western blot法或免疫组织化学法分别检测肝组织PREP、基质金属蛋白酶-8/9、胸腺素β4、金属蛋白酶Meprin-α以及炎症、脂质代谢相关基因和蛋白的表达。结果:高脂高胆固醇饮食处理满4w时小鼠可形成轻度脂肪变性,满8w可达早期NASH,此后NASH呈进行性发展,满16w模型组小鼠出现显著代谢紊乱;肝组织PREP蛋白水平在对照组和模型组之间无统计学差异,但从8w开始模型组血清中PREP活性随造模时间的延长呈动态升高,至造模16周,肝内和血清中活性均显著高于对照组(p均0.05)。在造模12w末和16w末,模型组肝组织内PREP m RNA、基质金属蛋白酶8/9 m RNA相对表达量和基质金属蛋白酶8/9蛋白水平均显著高于对照组(p均0.05),而胸腺素β4、Meprin-α蛋白水平均低于对照组(p均0.05)。抑制剂干预研究发现,模型组肝组织内炎症因子及成脂相关基因表达增加,经过6周PREP特异性抑制剂KYP-2047干预后,肝组织内升高的PREP活性被显著抑制,干预组小鼠肝脏炎症和脂肪变明显减轻,肝酶、胰岛素抵抗指数、炎症和脂质代谢相关因子均显著改善。结论:小鼠肝组织PREP活性在NASH阶段显著升高,可能参与小鼠NASH的进展;应用PREP特异性抑制剂能显著改善高脂饮食诱导的小鼠NASH阶段肝脏炎症和脂肪变,这一作用伴随肝内炎症因子表达下调、脂代谢相关因子和胰岛素抵抗改善。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575
【部分图文】：

高脂饮食 12w 末，模型组小鼠肝脏红偏黄，体积较肿大，部分被膜不光滑，边缘较顿，切面明显油腻感，质地欠软（图 1G）。高脂饮食 16w 末，模型组小鼠上述改变更加明显，肝脏色泽偏黄，体积明显肿大，被膜不光滑，边缘顿，切面明显油腻感，质地不柔软（图 1H）。

肝小叶结构完整，肝血窦清晰，肝细胞大小相似，胞质丰富，核圆位于细胞中央（图2A、2B、2C、2D）。高脂饮食 4w 末，模型组肝组织出现轻度脂肪变性，肝细胞内出现少量微小的脂肪空泡，肝索、肝窦较清晰，肝小叶分界清楚，部分可见轻度肝细胞水肿，细胞内胞浆丰富，核居中，汇管区无明显炎症细胞浸润（图 2E）。高脂饮食 8w 末，模型组肝组织出现轻中度脂肪变性，肝细胞内出现中等量大小不等的脂肪空泡，肝索排列紊乱，肝血窦变形狭窄，小叶结构消失，部分可见气球样变性（图 2F）。高脂饮食 12w 末，模型组出现中重度脂肪变性，肝细胞内出现大量大小不等的脂肪空泡，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄甚至消失，肝细胞胞浆疏松，气球样变性多见，汇管区少量炎症细胞浸润（图 2G）。高脂饮食 16w 末，模型组出现重度脂肪变性，肝细胞内出现大量大泡性脂肪空泡，肝索排列紊乱，肝血窦消失，肝细胞广泛气球样变性，汇管区有炎症细胞浸润和点状坏死（图 2H）。各组小鼠肝脏 NAS 评估结果见表 9。在 8w、12w 和 16w 末，分别有 5 只、8 只和 10 只小鼠 NAS＞=4 分。

通大学硕士学位论文 Shanghai Jiaotong U组小鼠 PREP 及相关蛋白肝内的表达情况。1 各组小鼠肝组织中 PREP mRNA 和蛋白表达情况与对照组相比，模型组肝内 PREPmRNA 相对表达量伴随造模时间的延长趋势，并在造模 12w 和 16w 末，相比于对照组，差异具有统计学意义（p＜ 3A），但蛋白水平在各个周期末，模型组和对照组之间无统计学差异（图
【参考文献】

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1 周达;陈源文;范建高;;脯氨酰寡肽酶的肝内生物学功能研究进展[J];胃肠病学和肝病学杂志;2015年01期

本文编号：2852777