非酒精性脂肪肝病的发病机制及腺病毒介导WT-JNK1对其发病的作用

发布时间：2020-10-24 18:52

　　 第一章SD大鼠胰岛素抵抗非酒精性脂肪肝病模型的构建 目的:构建SD大鼠胰岛素抵抗(IR)非酒精性脂肪肝病(NAFLD)动物模型。 方法:雄性SD大鼠32只,随机分为正常饮食组和高脂饮食组各16只。正常饮食组喂养普通饲料(脂肪占摄入能量的19%),高脂饮食组喂养高脂饲料(脂肪占摄入能量的45%),喂养8周。8周末使用正常血糖—高胰岛素钳夹技术稳态时的葡萄糖输注率(GIR)来评价胰岛素敏感性;抽取门静脉血测定空腹血糖(FBS)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST);游离肝脏称肝湿重,计算肝指数(肝湿重(g)/体重(g)×100%);光镜下HE染色和苏丹三染色对肝脏的脂肪变性情况进行评定。 结果:肝组织病理学检查显示,高脂饮食组大鼠肝细胞均呈现弥漫性大泡性脂肪变性,发展为NAFLD,正常饮食组肝脏无异常;与正常饮食组相比,高脂饮食组大鼠肝指数、GIR、FIRI、血清ALT、AST、胰岛素、TG、TC均明显增高,比较均有统计学差异(p＜0.05)。 结论:SD大鼠持续8周高脂饮食喂养成功构建了IR NAFLD动物模型。该模型的代谢特征为IR、高胰岛素血症、高脂血症及血清转氨酶升高 第二章高脂饮食诱导SD大鼠胰岛素抵抗非酒精性脂肪肝病机制的初步探讨 目的:探讨SD大鼠高脂饮食诱导胰岛素抵抗(IR)非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的分子机制:肝脏c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)蛋白表达及胰岛素受体底物-1丝氨酸307(IRS-1 Ser~(307))磷酸化水平的变化,阐明JNK1蛋白在NAFLD形成中对IR的作用的分子机制;氧化应激及脂肪因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)改变在IR NAFLD形成中的作用。 方法:SD大鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组,喂养8周后处死动物留取标本,检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)、游离脂肪酸(FFAs)及TNF-α的变化,应用免疫组织化学方法检测JNK1蛋白在肝组织中的表达,应用Western blot检测JNK1蛋白含量和IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平。 结果:与正常饮食组大鼠相比,高脂饮食组大鼠的肝组织匀浆MDA、FFAs、TNF-α明显增高,SOD明显降低,均有统计学差异(P＜0.05)。JNK1蛋白免疫组织化学显示:与正常饮食组相比,高脂饮食组大鼠肝组织JNK1抗体阳性细胞胞浆染色棕褐色,正常饮食组大鼠肝组织无明显JNK1抗体阳性细胞,高脂饮食组大鼠肝组织JNK1抗体阳性细胞约10%。高脂饮食组JNK1蛋白表达增高,并与IR呈正相关,IRS-1 Ser~(307)的磷酸化水平较正常饮食组明显增高,有统计学差异(P＜0.05)。 结论:高脂饮食诱导的SD大鼠IR NAFLD的部分分子机制可能为:JNK1在肝脏表达增高,并通过上调IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平,干扰了胰岛素与胰岛素受体结合后的信号传导,最终减弱胰岛素的生理作用,导致IR;TNF-α及氧应激-脂质过氧化损伤是高脂饮食诱导IRNAFLD的机制之一。 第三章应用AdEasy腺病毒载体系统构建WT-JNK1重组腺病毒 目的:制备表达野生型c-Jun氨基末端激酶1(WT-JNK1)复制缺陷型重组腺病毒。 方法:将重组穿梭载体pAdTrack-CMV-WT-JNK1线性化后,与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组得到重组腺病毒载体。将重组腺病毒载体转染入包装细胞HEK293内制备复制缺陷型重组腺病毒,并经PCR及DNA测序鉴定,扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度。 结果:JNK1重组腺病毒载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,搜集的病毒经过PCR扩增得到特定JNK1基因片段并测序鉴定正确,并扩增出2.5×10~(10)pfu/ml的高滴度重组腺病毒。 结论:该研究成功构建了JNK1重组腺病毒,为进一步研究JNK1的作用及应用JNK1进行相关疾病的基因防治研究奠定了基础。 第四章应用腺病毒载体过表达WT-JNK1对NAFLD的影响及机理 目的:应用腺病毒载体过表达野生型c-Jun氨基末端激酶1(WT-JNK1)基因,研究其对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的形成过程的影响,进一步探讨JNK1在胰岛素抵抗(IR)NAFLD发病中的作用。 方法:SD大鼠随机分为高脂对照组、Ad-GFP组、表达WT-JNK1的腺病毒(Ad-WT-JNK1)组。均用高脂饲料喂养8周。实验第一周,高脂对照组尾静脉注入生理盐水,Ad-GFP组尾静脉注入2×10~(10)pfu的Ad-GFP,Ad-WT-JNK1组尾静脉注入2×10~(10)pfu的Ad-WT-JNK1,8周末进行正常血糖高胰岛素钳夹实验检测IR;抽取门静脉血留取标本,检测空腹血糖(FBS)、空腹胰岛素(FINS)、甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、游离脂肪酸(FFAs)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等指标;观察肝组织脂肪变性;应用免疫组织化学方法检测JNK1蛋白在肝组织中的表达,应用Western blot检测JNK1蛋白含量和IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平。 结果:与高脂对照组和Ad-GFP组相比较,Ad-WT-JNK1组大鼠肝组织脂肪变性明显加重,并出现炎症性改变,TG、TC、ALT、AST明显增高,高胰岛素血症进一步加重,IR水平更加严重;MDA及TNF-α水平明显增高,SOD水平明显降低;JNK1蛋白表达及IRS-1Ser~(307)磷酸化水平明显增高,比较均有统计学差异(均P＜0.05)。与高脂对照组相比,Ad-GFP组大鼠动物的体重、肝指数、生化学指标、GIR、肝组织脂肪变性情况、JNK1蛋白表达及IRS-1 Ser~(307)磷酸化水平均无明显差异。动物注射腺病毒后,均未出现皮肤过敏等反应异常,动物死亡等现象。 结论:WT-JNK1重组腺病毒基因转染SD大鼠后,能明显上调JNK1蛋白的表达,通过作用于IRS-1 Ser~(307)磷酸化导致IR,加重了NAFLD的发生和发展,腺病毒能够安全应用于SD大鼠IR NAFLD发病机制的研究。
【学位单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R575.5
【部分图文】：

病理学变化NG大鼠肝脏呈暗红色，无异常变化;FG大鼠肝脏体包膜紧张，边缘圆钝，肝脏呈奶黄色，切面油腻。光镜片，NG肝索结构正常，无肝细胞脂肪变性和炎症细胞浸周末时出现以大泡性为主的脂肪变性，HE染色显示胞浆边，偶可见小叶内炎症细胞浸润，苏丹三染色见肝细胞小叶内脂肪变性的肝细胞所占比例为40.2社3.62(%)，未出现肝纤维化。见图1一3至图1一8。

核居边，偶可见小叶内炎症细胞浸润，苏丹三染色见肝细胞内有大量橘红色脂滴，肝小叶内脂肪变性的肝细胞所占比例为40.2社3.62(%)，达到了脂肪肝的标准;未出现肝纤维化。见图1一3至图1一8。图1一 3NG大鼠肉眼观图1一 4FG大鼠肉眼观

NG、FG大鼠FBS、FINS的变化
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本文编号：2854854