肠道微生态平衡与失衡对肠道Reg Ⅲ及GLP-1表达的影响及机制研究

发布时间：2020-10-26 03:10

　　 目的:肠道微生态与宿主之间和谐共存,互惠互利,宿主为微生态提供赖以生存的环境和营养,微生态为人类肠道代谢及免疫系统的发育和成熟提供必要的营养素,肠道菌群对维持正常消化吸收、能量代谢和免疫稳态至关重要。而失衡的肠道微生态,将导致肠道免疫及能量代谢稳态失衡,导致肠道免疫紊乱、易于感染,及与肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的发生密切相关。再生基因Ⅲ(Reg Ⅲ)蛋白,为肠道表达的一类具有抵御肠道内细菌及病原微生物能力的抗菌肽,发挥对宿主的固有防御作用,在肠黏膜免疫中发挥重要作用。胰高血糖素样肽-1(GLP-1),由G蛋白偶联受体43(GPR43)介导肠道L细胞合成,具有重要的能量代谢调节作用。本研究拟构建肠道菌群平衡与肠道菌群失衡模型,通过对肠黏膜免疫及肠道激素关键靶点的检测,探讨平衡与失衡状态的肠道菌群对宿主肠黏膜免疫及肠道激素的影响及潜在机制。第一部分肠道微生态调节肠道Reg Ⅲ表达及相关免疫机制研究方法:以无菌小鼠为研究对象,通过粪菌移植构建肠道微生态平衡模型,以同龄无菌小鼠为对照;以SPF小鼠为研究对象,应用万古霉素干预构建肠道微生态失衡模型,以正常SPF小鼠为对照。通过免疫组化染色和Real-time RT-PCR的方法,检测肠道组织抗菌肽Reg Ⅲ的表达及相关细胞因子表达谱。体外实验,以人类结肠腺癌Caco-2细胞系为研究对象,验证相关细胞因子诱导抗菌肽Reg Ⅲ表达的作用。结果:1、接受肠道菌群移植4周后的无菌小鼠,与正常无菌小鼠相比,其肠道抗菌肽Reg Ⅲgm RNA及蛋白表达水平上调;接受万古霉素干预1周后的SPF小鼠,与正常SPF小鼠相比,其肠道抗菌肽Reg Ⅲgm RNA及蛋白表达水平下调。2、接受肠道菌群移植4周后的无菌小鼠,与正常无菌小鼠相比,其肠道Th17相关细胞因子(IL-6,IL-17A,IL-22)m RNA表达水平上调;接受万古霉素干预1周后的SPF小鼠,与正常SPF小鼠相比,其肠道Th17相关细胞因子(IL-6,IL-17A,IL-22)m RNA表达水平下调。3、肠道抗菌肽Reg Ⅲgm RNA表达水平与肠道Th17相关细胞因子(IL-6,IL-17A,IL-22)m RNA表达水平呈正相关。4、肠道Th17效应细胞因子(IL-17A和IL-22)可能通过上调细胞内STAT3通路,参与诱导人类Caco-2细胞系抗菌肽Reg Ⅲ的表达。第二部分肠道微生态失衡调节肠道GLP-1表达及相关功能研究方法:以SPF小鼠为研究对象,应用不同浓度万古霉素饮水干预构建肠道微生态失衡动物模型,以正常SPF小鼠为对照;以无菌小鼠为研究对象,将经万古霉素诱导的失衡的肠道粪菌,通过粪菌移植技术移植给无菌小鼠,构建肠道菌群失衡移植模型,以接受正常粪菌移植的无菌小鼠为对照。检测实验小鼠体重、摄食量、血糖及全消化道动力。通过免疫组化染色、Real-time RT-PCR、ELISA等方法,检测肠道组织GLP-1、GPR43的表达,及血清GLP-1的表达水平。结果:1、接受万古霉素(0.2mg/ml)饮水干预5周后的SPF小鼠,与正常SPF小鼠相比,其摄食量、体重增长率相对较高,其GITT相对较长;接受失衡菌群移植5周后的无菌小鼠,与接受正常菌群移植5周后的无菌小鼠相比,其摄食量、体重增长率均相对较高;其GITT相对较长。2、接受万古霉素(0.2mg/ml)饮水干预5周后的SPF小鼠,与正常SPF小鼠相比,其空腹血糖水平、血清GLP-1水平相对较高;接受失衡菌群移植5周的无菌小鼠,与接受正常菌群移植5周的无菌小鼠相比,其空腹血糖水平、血清GLP-1水平相对较高。3、接受万古霉素(0.2mg/ml)饮水干预5周后的SPF小鼠,与正常SPF小鼠相比,其肠道组织Proglucagon m RNA、GLP-1蛋白阳性细胞水平相对上调表达;接受失衡菌群移植5周的无菌小鼠,与接受正常菌群移植5周的无菌小鼠相比,其肠道组织Proglucagon m RNA、GLP-1蛋白阳性细胞水平相对上调表达。4、接受万古霉素(0.2mg/ml)饮水干预5周后的SPF小鼠,与正常SPF小鼠相比,其肠道组织GPR43受体m RNA和蛋白水平相对上调表达;接受失衡菌群移植5周的无菌小鼠,与接受正常菌群移植5周的无菌小鼠相比,其肠道组织GPR43受体m RNA和蛋白水平相对上调表达。结论:1、肠道微生态调节肠道抗菌肽Reg Ⅲ的表达。肠道微生态可能通过调节肠道Th17细胞效应细胞因子(IL-17、IL-22)介导肠道上皮细胞Reg Ⅲ的表达。2、万古霉素诱导肠道菌群失衡调节肠道GLP-1的表达。失衡的肠道菌群,可能通过GPR43/GLP-1通路,对宿主消化道动力及能量代谢产生影响。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R57
【部分图文】：

天津医科大学博士学位论文 一、肠道微生态调节肠道 Reg III 表达及相关免疫机制研究1.2 结果1.2.1 肠道菌群移植对无菌小鼠肠道组织病理学的影响接受肠道菌群移植 4 周后的无菌小鼠，以未接受菌群移植的同龄无菌小鼠为对照，各实验组肠道组织进行 HE 染色，观察病理学改变，结果发现：未接受菌群移植的无菌小鼠，小肠壁较薄，小肠绒毛发育不成熟，排列稀疏，未见病理异常，小肠腺体稀疏，肠黏膜淋巴样细胞贫乏；接受肠道菌群移植 4 周后的无菌小鼠，小肠肠壁明显增厚，小肠粘膜发育良好，小肠绒毛丰厚，排列紧密，未见病理异常，小肠腺体丰富，腺窝深度增加，黏膜淋巴样细胞丰富（图 1.1）。同样的，未接受菌群移植的无菌小鼠，结肠壁较薄，排列稀疏，未见病理异常，结肠腺体稀疏，肠黏膜淋巴样细胞贫乏；接受肠道菌群移植 4 周后的无菌小鼠，结肠壁明显增厚，结肠粘膜发育良好，未见病理异常，结肠腺体丰富，腺窝深度增加，肠黏膜淋巴样细胞丰富（图 1.1）。

天津医科大学博士学位论文 一、肠道微生态调节肠道 Reg III 表达及相关免疫机制研究平结果一致。可见，无菌小鼠肠道抗菌肽 Reg III 低水平表达，肠道菌群移植 4周，可重构无菌小鼠肠道抗菌肽 Reg III 的表达，也就是说肠道共生菌在维持肠道抗菌肽 Reg III 的表达中发挥重要作用。

图 1.4 T 细胞分化相关细胞因子谱系图为检测肠道菌群移植对无菌小鼠肠道适应性免疫及 T 细胞分化的影响和改变，我接下来应用 Real-time RT-PCR 的方法对实验小鼠肠道组织细胞因子表达谱的 mRNA 水平进行检测。结果发现：接受菌群移植 4 周后的无菌小鼠小肠和结肠组织 IL-12 mRNA 表达水平显著低于未接受菌群移植的无菌小鼠（图 1.5A），差异有显著统计学意义（P<0.05）；接受菌群移植 4 周后的无菌小鼠小肠和结肠组织 INF- mRNA 表达水平与未接受菌群移植的无菌小鼠无明显差异（图 1.5 B）；接受菌群移植 4 周后的无菌小鼠小肠和结肠组织 IL-4 mRNA 表达水平与未接受菌群移植的无菌小鼠无明显差异（图 1.5 C）； 接受菌群移植 4 周后的无菌小鼠小肠（P<0.01）和结肠（P<0.05）组织 IL-6 mRNA 表达水平显著高于未接受菌群移植的无菌小鼠，差异有显著统计学意义（图 1.5 D）；同样的，接受菌群移植 4 周后的无菌小鼠小肠和结肠组织 IL-17A mRNA 表达水平均显著高于未接受菌群移植的无菌小鼠（图 1.5 E），差异有显著统计学意义（P<0.01）；同样的，接受菌群移植 4 周后的无菌小鼠小肠和结肠组织 IL-22 mRNA 表达水平均显著高于未接受菌群移植
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本文编号：2856396