Tfh和Tfr细胞的比例失衡在自身免疫性肝炎发病机制中的作用研究

发布时间：2020-10-26 04:46

　　 目的:自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis,AIH)是一种慢性炎症性肝病,其特点是循环中自身抗体阳性和血清免疫球蛋白水平升高。研究发现,自身免疫性疾病中滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cells,Tfh细胞)和滤泡调节性T细胞(Follicular regulatory T cells,Tfr细胞)的比例失衡,导致大量的自身反应性B细胞的分化及致病性自身抗体的产生。本研究通过检测AIH患者及健康对照组外周血中Tfh、Tfr细胞的比例和外周血中IL-21的表达,并通过分析Tfh细胞比例改变对AIH患者脾脏生发中心反应和循环中浆细胞及记忆B细胞的影响,探讨Tfh和Tfr细胞的比例失衡在AIH发病中的潜在作用及其参与AIH发病中的具体机制。方法:1、收集于2018年1月-2018年9月在天津医科大学总医院消化科住院部就诊的AIH患者20例,所有受试者均未接受过药物治疗,并排除其他自身免疫性疾病和恶性肿瘤病史。健康对照组为15名来自体检中心,性别、年龄与AIH组相匹配的,既往无自身免疫性疾病或恶性肿瘤病史的查体者。收集各组受试者的静脉血,提取外周血单个核细胞(Peripheral blood monocular cell,PBMC)后,用流式细胞术(Flow cytometry)检测受试者外周血中Tfh细胞、Tfr细胞的比例并分析Tfh细胞与临床指标之间的相关性。RT-PCR分析AIH患者和健康对照组外周血中IL-21的表达情况。2、收集天津医科大学总医院病理科在2008年至2018年间纳入的自身免疫性肝炎肝硬化行脾切除术的患者6例和对照慢性肝病患者2例、外伤脾破裂患者2例,应用苏木精-伊红染色法和免疫荧光法观察各组患者生发中心的形态和CD4、CXCR5等蛋白的表达情况,并分析AIH患者脾切除术前后临床指标的改变。3、流式细胞术检测20名AIH患者和15名健康对照外周血中浆细胞和记忆B细胞的比例,分析AIH患者外周血中浆细胞、记忆B细胞与Tfh细胞及临床指标的相关性。结果:1.AIH患者循环中CD4~+CXCR5~+T细胞的比例为24.65±7.89,相比于健康对照组的(16.75±6.01),比例显著增加(P0.05)。其中,AIH患者外周血中CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh细胞的比例为3.26±0.85,比健康对照外周血中的(1.01±0.32)显著增加(p0.001);同时,AIH患者CD4~+CXCR5~+FOXP3~+Tfr细胞(0.87±0.46比例较健康对照组(1.26±0.44)减少(P0.05)。AIH患者外周血中CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh细胞与临床指标例相关性分析的结果表明,AIH患者的CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh细胞的数量与患者血清IgG呈正相关(r=0.6020,p=0.0174),与ALT、AST、ALP、GGT及IgM无明显相关。RT-PCR分别检测7名AIH患者和5名健康对照组外周PBMC中Tfh细胞的主要细胞因子IL-21的相对表达量。结果表明,相比于健康查体者,AIH患者外周血中IL-21的表达水平增加(3.49±1.5 vs 0.98±0.39,P0.01)。2.脾脏组织HE染色结果发现,AIH患者脾脏较乙肝肝硬化组和外伤脾破裂组生发中心体积增大,数目增多,形态不规则;同时,与外伤脾破裂患者相比,AIH肝硬化患者脾脏组织CD4~+CXCR5~+T细胞比例明显增加。AIH患者行脾切除后,血清IgG水平较术前明显下降,而ALT,AST,GGT,IgM等指标无明显差异。3.浆细胞和记忆B细胞的流式结果示,AIH患者外周血中CD19~+CD27~+CD38~(++)浆细胞的水平(3.08±1.2)显著高于健康对照组(1.39±0.61,P0.01);AIH患者外周血中的CD19~+CD28~+CD38~(-/+)记忆B细胞的比例为(26.91±4.85),相比健康对照组(2.34±5.09)显著增加(P0.001)。将AIH患者外周血中浆细胞和记忆B细胞的数目与CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh细胞的比例进行相关性分析,发现AIH患者外周血中的浆细胞和记忆B细胞均与Tfh细胞成正相关。临床指标的相关性分析结果显示,AIH患者外周血中的CD19~+CD27~+CD38~(++)浆细胞的数量与患者血清IgG(r=0.6393,p=0.0107)和IgM(r=0.5822,p=0.0228)呈正相关,而与ALT、AST、ALP和GGT无明显相关。结论:Tfh和Tfr细胞比例失衡通过导致脾脏生发中心反应的异常扩增,及促进浆细胞和记忆B细胞的过度分化参与AIH的发病。深入探索Tfh细胞和Tfr比例失衡的原因和关键靶点,可能为未来AIH治疗方法的研究提供新的方向。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575.1
【部分图文】：

图 1. B 细胞对 T 依赖抗原的反应注：1.原始 CD4+T 细胞由 T 细胞区呈同源抗原的树突状细胞激活，短暂地表 CXCR5 并迁移到 T-B 边界；2.活化的 B 细胞迁移到 B 细胞滤泡或 T 细胞区；.部分活化的 CD4+T 细胞可以获得 Tfh 细胞系的特征，稳定表达 CXCR5；这些fh 细胞迁移到 B 细胞滤泡；4. B 细胞滤泡中活化的 B 细胞被滤泡树突状细胞 Tfh 细胞进一步刺激；5.生发中心反应诱导同型交换亲和成熟 B 细胞向记忆 B胞或长寿浆细胞分化）综上所述， Tfh 和 Tfr 两种细胞可以通过调控 GC 形成、高亲和力自身抗体产生及体液免疫的程度参与自身免疫性疾病的发生。研究者已在 RA、SLE 等种常见的自身免疫性疾病中发现两种细胞的比例失衡，并且认为 Tfh 细胞和fr 细胞比例失调后进一步引起的过度的生发中心反应导致了体液免疫系统的过活化和自身抗体的产生。然而在 AIH 中无论是 Tfh 和 Tfr 细胞还是浆细胞和忆 B 细胞的研究均十分少见，因此本研究希望通过初步探索 AIH 患者外周血 Tfh 和 Tfr 细胞的表达情况，并对 AIH 患者脾脏中生发中心的反应和外周血细胞记忆 B 细胞的表达进行检测，探索它们之间的相关性以及它们在 AIH 发

计学方法据分析使用 IBM 公司的 SPSS23.0 统计软件。正态分布的计量资标准差（ x±s）表示，使用 t 检验分析；非正态分布的计量资料范围）表示，使用秩和检验分析。相关性分析使用 Spearman 相关侧 P<0.05 为显著相关。果用流式细胞术检测不同组受试者外周血中 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh征。流式检测设门策略如图 2 所示，根据前向角散射（FSC）和侧C）将 PBMC 中的淋巴细胞设为 1 门（图 2A）；将淋巴细胞中 C为 2 门（图 2B）；根据 BB515-CXCR5 荧光分析 AIH 组及健康对XCR5+（图 2C）；根据 APC-CD279 和 PE-Cyanine7-FOXP3 荧光 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 细胞（图 2D）和 CD4+CXCR5+FOXP3+TfD4+的表达情况（图 2E）；

图 3.CD4+CXCR5+T 细胞在 AIH 组和健康对照组中的表达1.2.2 AIH 患者外周血 CD4+CXCR5+PD-1+T 细胞的比例特征进一步分析 15 例 AIH 患者外周血中 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 细胞的表达，结果发现，AIH 患者外周血中 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 细胞比例为 3.26±0.85，相比于健康对照外周血中的 1.01±0.32，比例显著增加（p<0.001）。图 4. CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 在 AIH 组和健康对照组循环中的表达1.2.3 AIH 患者外周血 Tfr 细胞的比例特征同 时 ， 我 们 检 测 了 AIH 患 者 循 环 中 的 对 Tfh 细 胞 有 抑 制 功 能 的
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本文编号：2856513