大鼠骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究

发布时间：2020-10-26 22:38

　　 不管是急性肝衰竭还是慢性肝衰竭，尚无哪一种治疗方法能够达到满意的疗效。人工肝、原位肝移植、肝细胞移植等治疗方法已经用于临床很长时间，但由于种种因素限制了它们的应用，如费用高、供体来源缺乏、长期服用免疫抑制剂等。这种状况迫使人们去寻找更为有效和经济的新方法。 90年代，造血干细胞的临床应用逐渐开展起来，如地中海性贫血、白血病、实体瘤大剂量化疗或／和放疗后的造血恢复。在造血干细胞的临床应用和研究中，人们发现骨髓干细胞具有多向分化潜能，在一定环境下，可以转化为其它类型的成熟细胞如神经细胞、骨骼肌细胞等，人们推测骨髓中的干细胞可能是一个复杂的群体，具有不同的分化潜能和方向。 1999年有人报道骨髓造血干细胞可以转化为肝细胞。如果能使患者自身骨髓干细胞增殖和向肝细胞选择性分化，我们便可以用自身骨髓干细胞分化和增殖来替代肝脏功能，同时又能解决异体移植的供体来源缺乏及免疫排斥的问题，具有广阔的应用前景。 有人在骨髓细胞中分离出一类β_2m~-／Thy-1~+细胞，具有肝细胞的一些表型如白蛋白mRNA表达，并在体外诱导分化，出现新的肝细胞表型如CAM5.2，因此这类β_2m~-／Thy-1~+细胞可能是骨髓中的“肝脏干细胞”，骨髓中肝脏干细胞还有那些肝细胞特征，有必要进一步研究。 在骨髓细胞向肝细胞的转化实验中，常用射线照射去除受体动物自身骨髓，使供体骨髓细胞能大量的在受体骨髓腔定居、增殖。在二乙酰 郑州大学2002届博士论文 骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究 氨基拐（2－AAF）加 CCI。肝损伤模型中，己经发现移植的骨髓细胞可以 转变为肝细胞和 AFP用 脏前体细胞，也有人用小剂量的全身照射，证明 在无肝损伤的情况下，也有骨髓细胞向肝细胞的转化。虽然在体内研究中， 骨髓细胞在肝脏中可以转化为肝细胞，但其机制尚未阐明，推测细胞因子和 肝脏局部微环境起着重要作用。 本研究用3种动物模型进行交叉性别骨髓移植，探讨在不同条件下， 骨髓细胞向肝细胞转化的情况，并分析2－AAF对骨髓细胞转化率的影响。 联合双向聚丙烯酚胺凝胶电泳 Q．PAGE）及质谱（MS）进行蛋臼 质组研究是目前广泛应用的方法，这一技术可以比较不同的细胞或组织 蛋白质组的差异，对于研究细胞的分化、肿瘤、衰老具有重要意义。为 此，我们初步在本实验室建立ZD－PAGE实验技术，对2．AAF＋PH（部分 肝切）模型肝切前后的肝组织的总蛋白进行分离，并找出肝切前后的差 异蛋白质点，希望从中找到促使肝脏干细胞活化和骨髓干细胞向肝细胞 转化的细胞因子。 材料 禾方法： 本实验用免疫组化、逆转录PCR和 Western blot方法，对骨髓细胞甲胎 蛋自mRNA和蛋白的表达进行分析，以确定骨髓细胞中肝脏干细胞标志一甲 胎蛋白的表达情况。用逆转录PCR、巢式PCR和基因序列测定检测骨髓细胞 中白蛋白mKNA表达情况。 分离大鼠骨髓单个核细胞，分3组进行培养：l）单纯培养基对照组，（含 胎牛血清15％人2）大鼠肝损伤血清组（用2－＊AF十＊H肝切模型大鼠肝切后； 血清替代胎牛血清人 3）HGF组＊牛血清 1％，加肝细胞生长因子 20ng／mL人 用免疫组化、逆转录 PCR和 Western blot方法，以观察大鼠肝损伤血清和 HGF 对骨髓细胞转化的促进作用。 将雌性 SD大鼠随机分为 3组，每组 15只。l）R＋BMT（全身照射＋ 骨髓移植＼ 2）2－AAF＋R＋BMT；3）2．AAF＋PH＋BMT。2．AAF采用灌胃 法。各组进行交叉性别骨髓细胞移植，将雄性骨髓移植入雌性受体内， 以雄性性别诀定基因 sry作为细胞标记，用原位杂交和 FISH作为检测方 2 郑州大学2O02届博士论文 骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究 法进行骨髓细胞向肝细胞转化的分析。 用雌性SD大鼠6只，做2－AAF＋PH模型，进行肝切前后肝脏蛋白质 ZD．PAGE电泳，分析蛋白差异。 结果显示： 1．PCR移植效果初步分析可见，R＋BMT组门例中有 10例 PCR阳性； ZAAF＋PH＋BMT组门例中有 7例阳性，ZAAF＋R＋BMT组 10例中有 6例阳性。 2．sry原位杂交染色发现，第5大各组雌性受体肝索中均未见sry阳性的肝 细胞。 3．第 10大 R＋BMT组可见一例 Sry阳性的细胞位于肝细胞索，FISH染色可 见这一细胞白蛋白mKNA阳性。 4．第20天各组PCR阳性各例均可在肝索中检测到Sry阳性的细胞。FISH 染色可见白蛋白mRNA阳性。 5．经统计学分析第20大各组Sry阳性细胞数无明显差异（P＞0刀5人 6．AFP兔疫组化染色可见，新鲜骨髓细胞和单纯 IMDM／F培养基组呈阴 性；肝损伤血清组和 HGF组培养后 10． 20天，细胞爬片 AFP免疫组化 染色阳性。 7．AFP
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R575.305
【部分图文】：

图1一1PCR法Bio一白蛋白探针合成为未标记的PCR产物，2、4为标记后PCR产物，5A参照;白蛋白标记前为463bp。234567SO0bP250bP
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本文编号：2857614