13种非酒精性脂肪肝并发症相关物质的HPLC测定方法的建立及应用

发布时间：2020-10-28 06:17

　　 背景非酒精脂肪肝病(NAFLD)是指除因酒精摄入过多、自身免疫、病毒感染等所导致的肝脏实质细胞的脂肪变性。尽管目前NAFLD的机制和NASH的进展机制尚不清楚,有人提出,可能与各种肝损伤形式相同的支链氨基酸紊乱有关,在慢性肝病,特别是肝硬化中,支链氨基酸减少,芳香氨基酸增加。目前,较少使用HPLC-FLD法同时测定多种氨基酸的含量,因此,本文分为二个部分分别探讨同时测定13种物质含量的HPLC-FLD方法以及13种物质在非酒精性脂肪病病程中的含量变化。第一部分小鼠脑组织中13种氨基酸的含量测定方法的建立目的:建立同时测定小鼠脑组织中13种物质的HPLC-FLD方法。方法:采用安捷伦1260高效液相色谱仪。实验检测的激发波长和发射波长分别为340 nm和455 nm。利用ODS2柱分离各分析物,柱温为30℃。采用HPLC梯度洗脱法,以1mL·min~(-1)的流速进行测定。流动相A为100%乙腈。流动相B为30 mmol·L~(-1)乙酸钠水溶液。进样量为20μL,样品单次运行的总时间为45 min。小鼠脑组织经预处理后柱前衍生化后进样测定分析。结果:13种目标物的标准曲线的相关系数R~2均大于0.9996,线性关系良好。除Val和Phe(0.9μmol·L~(-1))外,其余化合物的LOQ均低于0.1μmol·L~(-1),所有物质的LOD均低于0.05μmol·L~(-1)。低、中、高浓度时,日内精密度的RSD分别小于2.23%、4.41%和2.08%;日间精密度的RSD分别小于8.65%、3.90%和4.88%。准确度表示为相对回收率(RR),RR在77.52%到111.58%之间。提取回收率在75.74%到96.42%之间。结论:本研究所建立的检测13种氨基酸的HPLC-FLD方法适用于非酒精性脂肪肝病并发症相关物质的分离与测定。第二部分C57BL/6、RIP3、Mfge8和C3R各品系的雄性小鼠脑组织中13种氨基酸的含量测定目的:测定C57BL/6、RIP3、Mfge8和C3R共4个品系的雄性小鼠脑组织中13种氨基酸的含量,研究13种氨基酸的含量变化对非酒精性脂肪肝病的影响与相互关系。探讨不同品系小鼠对非酒精脂肪小鼠模型建立的影响。方法:采用本文第一部分所建立的方法。结果:随着喂养时间的增加,喂养MCD饲料9周后的C57BL/6小鼠脑组织中氨基酸均发生不同程度的变化,Asp、Gln、GABA和Ile的含量均能在一定程度上恢复正常,但在最后喂养18周后氨基酸含量又会出现显著降低。通过对RIP3、Mfge8和C3R三个品系小鼠的比较,发现同样喂养MCD饲料9周时,不同品系小鼠脑内氨基酸的含量并没有显著性差别,且3个品系小鼠脑组织中各氨基酸的变化比较一致,均有Asp的变化。在同样喂养MCD饲料18周时,Mfge8、RIP3和C3R小鼠脑组织中氨基酸含量存在差距的种类最多;而RIP3和C3R小鼠脑组织中氨基酸含量无明显差别。结论:C57BL/6和Mfge8品系适合用于建立非酒精性脂肪病模型小鼠。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575.5
【部分图文】：

11图2. 13种待测物质及内标的化学结构Fig.2 The chemical structures of thirteen substances and internal standards (IS)

-1的 OPA 作为衍生化试剂。图1.1 OPA用量对各待测物峰面积的影响Fig. 1.1 The effect of OPAamount on peak area of analytes3.3.2硼酸钠缓冲溶液pH的选择查阅文献[31,32]发现，OPA 衍生化反应在酸性环境下不稳定，衍生化反应不完全，而硼酸钠缓冲液 pH 值为 7.6，不适合氨基酸的衍生化反应。在我们以往的研究[30]中，在衍生化反应过程中加入 10 μL1.0 mol·L-1碳酸钠溶液来调节衍生化反应环境的 pH 值，但此操作步骤在衍生化过程显得过于繁琐
【参考文献】

相关期刊论文 前5条

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本文编号：2859710