第一部分肠道内环境因素通过维生素D受体调节结肠上皮细胞屏障功能及机制的初探目的:探究维生素D受体(Vitamin D Receptor,VDR)调节结肠上皮细胞系屏障功能作用及其受肠道内部分环境因素(低氧及丁酸)影响的相关机制。方法:1.VDR敲降细胞系实验:1).采用Western blot法及RT-PCR法筛选两种高表达VDR的结肠上皮细胞系DLD-1和Caco2;2).采用慢病毒包装转染技术对两种细胞系进行VDR基因敲降,构建各自的稳转细胞系Sh-VDR(Small Hairpin-VDR)及对照 Sh-NC(Small Hairpin-Normal Control);3).跨膜电阻抗法(Transepithelial Electric Resistance,TEER)检测 DLD-1 VDR 敲降细胞系单层细胞完整性;4).Western blot法检测DLD-1,Caco2敲降细胞系紧密连接(Tight Junction,TJ)蛋白 Zo-l,Occludin 和黏合连接(Adhesive Junction,AJ)蛋白E-cadherin表达。2.体外低氧刺激VDR敲降细胞实验:1).将DLD-1分别给予低氧(1%O2)、维生素D(100 nM)及低氧联合维生素D处理48h。Western blot法检测各组细胞中紧密连接结构蛋白Zo-1,Occludin,Claudin-l和黏合连接蛋白E-cadherin及VDR的表达情况;2).对DLD-1的VDR敲降细胞系Sh-VDR及对照Sh-NC,给予低氧处理48h,检测上述蛋白的表达情况。3.体外丁酸刺激VDR敲降细胞实验:1).分别给予浓度为0.3mM-3miVJ丁酸处理DLD-1细胞48h,采用 RT-PCR 及 Western blot 法检测各组细胞中 Zo-1,0ccludin,E-cadherin 及VDR在mRNA水平及蛋白水平的表达情况；2).对DLD-1 Sh-VDR及对照Sh-NC,以0.3mmM 丁酸处理24h后,RT-PCR法检测各组细胞上述蛋白的表达情况。结果:1.VDR敲降细胞系实验:1).与对照组Sh-NC相比,DLD-l,Caco2 VDR基因敲降后TJ蛋白Zo-1,0ccludin及AJ蛋白E-cadherin表达均明显降低(n=5,P0.001);2).DLD-1敲降组Sh-VDR细胞系连续培养7天及11天后跨膜电阻抗值显著降低(n=3,22.0±3.28 vs.4.33±1.73，P=0.009;n=3,21.0±1.86 vs.9.33±0.58,P=0.004)。2.体外低氧刺激VDR敲降细胞实验·:1).与常氧条件培养的DLD-1对照组相比,DLD-1低氧处理48 h后紧密连接结构蛋白Occludin,Claudin-1及VDR表达增加(n=3，P0.001),低氧+维生素D联合处理组较单独维生素D处理组,除上述蛋白表达增加外,Zo-1及E-cadherin表达也明显增加(n=3，P0.001)；2).与未处理 DLD-1 Sh-VDR 组相比,DLD-1 Sh-VDR 细胞低氧处理后,Zo-1,Occludin,Claudin-1及E-cadherin表达均显著降低(n=3，P0.001，P0.001，P0.001，P0.01)。3.体外丁酸刺激 VDR 敲降细胞实验:1).与空白对照组相比,DLD-1在0.3mmM 丁酸处理48 h后紧密连接结构蛋白Zo-1,Occludin和黏合连接蛋白E-cadherin及VDR表达在蛋白水平及mRNA 水平均显著增加(n=3，P0.001，P0.001,10.001，P0.001)；2).与 DLD-1 Sh-NC和Sh-VDR空白对照组相比,DLD-1 Sh-NC及Sh-VDR细胞0.3mM 丁酸处理24h后,Zo-1,Occludin,E-cadherin 表达在 mRNA 水平均显著增加(P0.001,P0.01,P0.001),Sh-VDR细胞丁酸处理后VDR在mRNA水平也显著增高(P0.001)。结论:1.VDR敲降后,结肠上皮细胞系DLD-1,Caco2单层细胞屏障功能减低;2.低氧和菌群代谢产物丁酸可通过VDR调节结肠上皮细胞屏障蛋白;3.VDR对于低氧状态下结肠上皮细胞系DLD-1肠上皮屏障蛋白表达有调节作用,提示VDR通路可能为肠道低氧环境下保护肠黏膜屏障的重要机制之一。第二部分利用VDR敲除小鼠探究VDR调节肠黏膜屏障相关机制目的:利用VDR敲除(VDR Knock-out,VDR KO)小鼠探究VDR对肠黏膜屏障功能的调节作用。方法:1.VDR KO小鼠:1).利用CRISPR/spCas9技术构建C57BL/6品系VDR基因敲除首建鼠(Founder),采用后代中8-10周VDR KO纯合子VDR(-/-)及其同窝野生型(Wild Type,WT)对照VD(+/+)进行后续实验;2).小鼠活体共聚焦显微镜下荧光素渗漏实验检测VDR KO小鼠及WT对照小鼠结肠黏膜屏障通透性变化;3).Western blot法检测VDR KO小鼠及其WT对照小鼠结肠黏膜TJ蛋白Zo-1,Occludin和AJ蛋白E-cadherin在蛋白水平变化；4).16S V3-V4区测序法检测VDR KO小鼠及WT对照小鼠粪便菌群变化。2.VDR KO小鼠建立DSS模型实验方法:1).动物实验分组:8-10周WT VDR(+/+)及VDR KO小鼠VDR(-/-)分别分为对照组(Ctrl)和 DSS 处理组(DSS),即 Ctrl 组(n=4),Ctrl+DSS 组(n=4),K0组(n=4)及KO+DSS组(n=4),DSS处理组给予质量分数为1.5%的DSS饮用水5天,期间每日监测体重、大便性状及便潜血,选择第7天(D7)做为观察终点,记录结肠长度,大体评分及评估病理评分;2).用小鼠活体共聚焦荧光显微镜检测各组小鼠结肠黏膜屏障通透性变化;3).电镜观察小鼠结肠上皮间连接结构;4).用Western Blot法检测各组小鼠结肠黏膜TJ蛋白Occludin表达差异。结果:1.VDR KO小鼠:1).小鼠活体荧光素渗漏实验显示与WT组相比,VDR KO组小鼠结肠黏膜通透性增加,渗透评分显著增高(n=3,0±0 vs.1.1±0.74,P0.0001);2).电镜下(20000×)表现为KO组小鼠结肠上皮细胞间紧密连接结构不完整,边缘模糊,提示结肠屏障功能已部分受损;3).VDR KO组小鼠屏障蛋白Zo-1、Occludin和E-cadherin表达均明显降低(n=3,P0.001);4).小鼠粪便菌群16S V3-V4区测序结果显示:有两种与纤维降解相关,可产生包括丁酸,乙酸在内的短链脂肪酸的Ruminiclostridium及Anaerotruncus菌属在VDR KO组小鼠粪便中表达减低(n=5;P=0.023,P0.029),同为专性厌氧菌的Desulfovibrio及Odoribacter在VDR KO组小鼠粪便中表达也明显减低(P=0.041,P=0.003)。2.VDR KO小鼠建立DSS模型实验结果:1).1.5%DSS处理后D7天,与KO组相比,KO+DSS组小鼠疾病活动指数显著增高(0.25±0.50 vs.3.75±0.17,P=0.015),大体评分显著升高(0±0 vs.3.75±0.25，P=0.011),结肠长度明显缩短(7.72±0.17 vs.5.24土0.40,P0.001);病理学评分也显著增高(0±0 vs.22±2.48，P=0.014);小鼠结肠活体共聚焦荧光显微镜观察KO+DSS组结肠黏膜选择性通透功能几乎完全丧失,渗透评分升高,差异有统计学意义(P=0.022);电镜显示KO+DSS组小鼠结肠上皮间TJ及AJ结构严重破坏甚至消失;Western blot 法检测 KO+DSS 组 TJ 结构 Occludin 表达减低(P0.001)。2).与Ctrl+DSS组相比,KO+DSS组大体评分显著升高(2.50±0.29 vs.3.75±0.25,P=0.032),结肠短缩十分明显(6.83±0.23 vs.5.24±0.40，P=0.006);病理学评分显著增高(8.25±1.80vs.22.0±2.48，P=0.021),渗透评分也显著升高(1.2±0.13 vs.1.8±0.13,P=0.023),电镜表现同前,Western blot 法检测Occludin蛋白表达减低(P0.001)。结论:1.小鼠VDR基因敲除后,结肠黏膜屏障功能受损,粪便中产短链脂肪酸如丁酸的有益细菌显著减少;2.在较低浓度DSS处理后VDR KO小鼠结肠炎及屏障损伤表现更重伴上皮修复功能障碍;3.VDR的存在对结肠黏膜屏障功能及损伤修复有重要保护作用。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R57
【部分图文】：
Ｃａｃｏ２细胞ＶＤＲ表达，以及人胚胎肠黏膜组织来源细胞ＣＣＣ－ＨＩＥ。在ＲＴ－ＰＣＲ中，??可见ＳＷ４８０，?ＤＬＤ－１及Ｃａｃｏ２三种结肠癌细胞系ＶＤＲ表达较强，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ??法验证上述三种结肠癌细胞系ＶＤＲ均有明显表达（见图１?），选择ＤＬＤ－１及Ｃａｃ〇２??两种细胞系进行后续实验（ｎ?＝?３）。??Ａ?Ｂ??Ａ?§?＾?￣?ｏ??ＶＤＲ?＃?｜?＾?｜??＾?Ｖ．４〇／?Ｄ〇ｒ＼Ｕ；??｜?＿?３．?ＧＡＰＤＨ??ｕ＞＾?Ｅ?（３５ＫＤ）??兰?ｋ?Ｓ?〇－?＿?４－，?ｍ?ｓｖ／４８〇??ｗ?？?＜?Ｌ?ｃｆ?麵［＞〇）－ｉ??２５０?１１?３．?；ｒ?■?＿??〇?￣?－?ｍｍ?ｕ?１?歡馨?ＳＷ６２０??ｉｓ?Ｚ?［?ｓ＂｜?２－：??￡｜?〇Ｗ?．，＿—，—ｍ?ｎ?ｊ：：：．?１?■－??Ｚ?ｃ／?Ｚ?ｃ／??Ｃ／?ｃｄｉ?ｌｉｎｅｓ??ｃｅＨ?ｌｉｎｅｓ??图１：各种结肠上皮细胞系ＶＤＲ表达情况??注：图１Ａ，Ｂ分别示ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ法检测结肠癌细胞系ＳＷ６２０，??ＳＷ４８０
士标准误（Ｉ土ＳＥＭ）表示，两组间比较用两独（ＴｆｆｉＲ）法检测ＤＬＤ－１细胞系ＶＤＲ敲降后黏膜屏障ｅｌｌ小室中分别接种ＤＬＤ－１?Ｓｈ－ＮＣ和Ｓｈ－ＶＤＲ细，连续培养７天，分别检测两组细胞跨膜电阻抗值ｈ－ＶＤＲ细胞跨膜电阻抗值均显著降低（２２±５．６９?ｖｓ续培养１１天，Ｓｈ－ＶＤＲ细胞跨膜电阻抗值也显著０，片０．００４），见图?３?（ｎ＝３）。??Ｄ?ＬＤ－１??
?图９?丁酸对ＤＬＤ－１黏膜屏障蛋白表达的影响??注：图９Ａ，?Ｂ，?Ｃ分别示ＲＴ－ＰＣＲ检测０．?３ｍＭ及３ｍＭ?丁酸处理４８ｈ对ＤＬＤ－１细??胞?Ｚ〇－ｌ，?Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，?Ｏｃｃｌｕｄｉｎ?在?ｍＲＮＡ?水平表达的影响；Ｄ?图示?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ??法检测?０．?３ｍＭ，?０？?６ｍＭ?及?３ｍＭ?丁酸处理?４８ｈ?对?ＤＬＤ－１?细胞?Ｚｏ－１，?Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，??Ｏｃｃｌｕｄｉｎ在蛋白水平表达的影响??４０??
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本文编号：
2860808
