ERS与TRAIL在大鼠肝星状细胞凋亡中的相互关系探讨

发布时间：2020-10-29 12:05

　　肝纤维化是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质(extraceilularmatrix，ECM)弥漫性过度沉积的病理过程，是慢性肝病发展为肝硬化的中间环节。随着肝脏病变的发展,肝细胞坏死,肝实质弥漫性结节再生,胶原纤维大量沉积,最终导致肝组织结构改变,发展为不可逆转的肝硬化。近年来研究发现，肝纤维化在去除损伤因子后是可以逆转的，表现为胶原纤维沉积减少，肝组织病理程度减轻以及肝脏功能的恢复。而肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)在肝损伤和损伤修复中发挥重要作用，诱导肝星状细胞凋亡成为促进肝纤维化恢复的重要途径之一。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是近年来发现的肿瘤坏死因子家族新成员，可选择性的诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。我室前期研究发现，在肝纤维化恢复期，KC及活化的HSC可通过诱导TRAIL及其他凋亡刺激因子从而促进HSC的凋亡，促进ECM的降解，从而促进肝纤维化的逆转。内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)是继死亡受体活化和线粒体损伤之后第三条介导细胞凋亡的信号传导通路。在缺氧、氧化应激、钙离子稳态失衡情况下，内质网未折叠的蛋白质会明显增多，当超出内质网处理能力时，细胞激活相关信号级联反应应对外界条件变化，以恢复内质网良好的蛋白质折叠环境，即启动ERS，引起内质网生理功能发生紊乱。ERS作为一条新的细胞信号凋亡传导通路，可诱导多种细胞发生凋亡，与肝损伤、肝癌等多种肝脏疾病的发生密切相关。但ERS在肝纤维化形成与逆转过程中的作用尚不清楚。本实验通过采用CCl4诱导大鼠建立肝纤维化动物模型，研究ERS相关蛋白在肝纤维化病程中的动态变化情况，探讨ERS在肝纤维化病程中的作用。并在此基础上通过体外研究，进一步探索ERS与TRAIL在大鼠肝星状细胞凋亡中的相互关系，研究主要包括以下几部分： 1.大鼠肝纤维化模型中ERS相关蛋白的动态表达变化采用CCl4皮下注射12周建立大鼠肝纤维化模型，病理学HE染色及VG胶原染色显示，模型大鼠肝组织可见大量胶原纤维沉积扩展至小叶边缘，纤维间隔增厚，出现大量脂肪空泡。停止注射CCl44周、8周，肝组织纤维沉积程度明显降低，脂肪空泡减少，纤维间隔变小、变窄。提示在CCl4注射12周诱发肝纤维化模型建立成功，停止CCl4皮下注射4周、8周后，大鼠肝纤维化有自发的逆转倾向。免疫组化检测ERS相关蛋白表达发现，正常肝组织中ERS标志性蛋白CHOP和GRP78胞质淡染，表达较少。随着肝纤维化的形成，模型组CHOP和GRP78着色显著加深，阳性表达明显高于正常组，提示ERS反应与大鼠肝纤维化密切相关。进一步观察发现停止注射CCl44周、8周，肝纤维化进入逆转恢复期，此时CHOP、GRP78阳性表达随之降低，与模型组相比染色减淡，显示伴随着肝纤维化的逆转，ERS反应程度减轻。RT-PCR检测结果亦显示，CHOP、GRP78mRNA水平在肝纤维化模型期明显上调。与模型组相比，随着恢复4、8周纤维化病变程度减轻，CHOP、GRP78mRNA表达有所降低。提示肝纤维化启动了ERS反应，ERS参与了大鼠肝纤维化的发生、发展、逆转，并在此过程中发挥着重要作用。Westernblot结果均与上述一致。以上结果提示，ERS存在于大鼠肝纤维化进程中，可能与肝纤维化的发生、发展、逆转存在密切联系。 2.体外实验研究ERS与TRAIL在大鼠肝星状细胞凋亡中的关系及部分机制研究体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6，以毒胡萝卜素（Thapsigargin，TG）作为ERS诱导剂，熊去氧胆酸（Ursodeoxycholicacid，UDCA）为ERS抑制剂，SP600125作为JNK抑制剂，应用小分子RNA干扰技术沉默CHOP基因。流式细胞仪检测发现随着TG浓度增加（1μM，2μM，4μM，8μM，16μM），可诱导HSC-T6发生不同程度的凋亡；RT-PCR与Westernblot结果表明ERS标志性蛋白CHOP可诱导TARIL受体DR5的表达明显上调。同时，siCHOP及JNK抑制剂SP600125的应用，均可使HSC细胞中DR5的表达随之减少。以上结果表明CHOP和JNK可能是调节DR5表达的潜在因子，两者之间的密切关系在星状细胞的凋亡中发挥着重要的作用。综上所述，本实验证明了ERS参与了大鼠肝纤维化的发生、发展、逆转进程，并在此过程中发挥了重要作用；证明了TG可诱导HSC-T6细胞发生ERS进而引起凋亡；发现ERS与TRAIL在HSC-T6凋亡机制中存在着一定的联系。CHOP和JNK可能是调节DR5表达的潜在因子，对于TRAIL受体DR5的调控发挥着重要的作用。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R575.2
【文章目录】：
英文缩略词
中文摘要
Abstract
第一部分大鼠肝纤维化进程中内质网应激相关蛋白的动态变化研究
    1 前言
    2 实验材料
    3 实验方法
    4 结果
    5 讨论
    参考文献
第二部分 ERS 与 TRAIL 在大鼠肝星状细胞凋亡中的关系及部分机制
    1 前言
    2 实验材料
    3 实验方法
    4 结果
    5 讨论
    参考文献
结论
附录
致谢
综述
    参考文献

【参考文献】

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