戊型肝炎病毒ORF3及其候选互作蛋白原核表达载体的构建及表达纯化

发布时间：2017-04-05 01:10

  本文关键词：戊型肝炎病毒ORF3及其候选互作蛋白原核表达载体的构建及表达纯化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：戊型肝炎是一种重要的人兽共患病，主要流行于发展中国家，既有暴发流行也有散发病例，对人类健康造成威胁。戊型肝炎病毒（HEV）是无包膜的单股正链RNA病毒，，包含三个开放阅读框（ORF）。其中HEVORF3编码约114个氨基酸的蛋白，蛋白的主要功能目前尚不确定。有研究表明它在病毒感染细胞而引发的信号转导过程中发挥着极其重要的作用，与各病毒流行株基因型间的差异性相关，对于HEV疫苗和诊断试剂盒的开发具有重要意义。本研究通过原核表达系统表达纯化了HEVORF3及其候选互作蛋白RPS11蛋白，并对两者的体外相互作用进行了初步探究，结果如下： 本研究以基因4型HEVORF3的cDNA为模版，PCR扩增ORF3片段。选取pET28a、pGEX4T1、pET43a为原核表达载体，并构建His-pGEX4T1双标签表达载体。将酶切后带有粘性末端的载体和ORF3片段连接，转入大肠杆菌DH5α。将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析表明4个融合蛋白均得到正确、高效表达。利用Ni-NTA对pET28a-ORF3进行纯化,BandScan5.0生物图像分析软件分析表明：表达的融合蛋白占菌体蛋白总量量的百分比为55.7%,纯化后融合蛋白的纯度为41.6%。利用GST柱对pGEX4T1-ORF3进行纯化,BandScan5.0分析表明：蛋白的表达量为68.8%,蛋白纯度为69.1%。带有His和GST双标签的His-pGEX4T1-ORF3蛋白通过Ni-NTA和GST柱两次纯化,分析表明融合蛋白的纯度得到了明显提高,达到93.8%。带有NusA促溶标签的pET43a-ORF3通过Ni-NTA纯化后,分析其蛋白表达量为62.3%,纯度为88.5%,而且融合蛋白(?)IusA-ORF3的可溶性表达较高。纯化的HEV ORF3蛋白为ORF3蛋白的结构和功能、与其受体蛋白相互作用及戊肝基因工程疫苗的研究提供了基础。 通过PCR扩增RPS11基因,构建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌DH5a,菌液PCR筛选阳性结果。序列测定正确后,将其转入大肠杆菌BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,融合蛋白均能够正确、高效表达。利用GST柱对pGEX4T1-RPS11蛋白进行纯化,BandScan5.0分析结果显示融合蛋白的表达量为24.6%,纯化的融合蛋白纯度为95.2%。利用Ni-NTA柱对pET43a-RPS11蛋白进行纯化,分析显示融合蛋白的表达量为48.3%,蛋白纯度为95.0%。 通过GST Pull-down方法对纯化的ORF3和RPS11融合蛋白的体外相互作用进行了初步探究。为ORF3蛋白互作蛋白的筛选和鉴定奠定了基础。
【关键词】：戊型肝炎病毒 ORF3 原核表达 RPS11
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.6
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1 戊型肝炎病毒的研究概况12-18
• 1.1 病原学12-14
• 1.2 蛋白晶体结构学14-15
• 1.3 流行病学15-17
• 1.4 疫苗的研制17
• 1.5 HEV重组蛋白在疫苗研发中的应用17-18
• 2 戊型肝炎病毒ORF3的研究进展18-22
• 2.1 HEVORF3的分子生物学特性18-19
• 2.2 HEVORF3的生物功能19-21
• 2.3 ORF3蛋白在基因工程疫苗中的应用21-22
• 3 本研究的目的与意义22
• 第二章 戊型肝炎病毒ORF3蛋白的原核表达及纯化22-45
• 1 材料22-24
• 1.1 菌株和质粒22-23
• 1.2 主要试剂23
• 1.3 主要仪器23-24
• 2 实验方法24-33
• 2.1 目的基因的克隆及纯化24-25
• 2.2. 重组表达载体的构建25-29
• 2.3 融合蛋白的表达检测29-31
• 2.4 融合蛋白的纯化31-33
• 3 结果33-41
• 3.1 HEVORF3基因的PCR扩增结果33-34
• 3.2 HEVORF3片段和载体质粒酶切结果34
• 3.3 重组表达质粒的构建及鉴定34-36
• 3.4 融合蛋白的表达检测36-38
• 3.5 融合蛋白的纯化38-41
• 4 讨论41-45
• 第三章 人核糖体40s亚基RPS11蛋白的原核表达和纯化45-56
• 1 材料45-46
• 1.1 菌株及质粒45
• 1.2 主要试剂45
• 1.3 主要仪器45-46
• 2 实验方法46-50
• 2.1 目的基因的扩增及纯化46-47
• 2.2 重组表达载体的构建47-48
• 2.3 融合蛋白的表达检测48-49
• 2.4 融合蛋白的纯化49-50
• 3 结果50-54
• 3.1 RPS11基因的PCR扩增结果50-51
• 3.2 重组表达质粒的鉴定51-52
• 3.3 融合蛋白的表达检测52-53
• 3.4 融合蛋白的纯化53-54
• 4 讨论54-56
• 第四章 HEVORF3与候选互作蛋白相互作用的初步探究56-61
• 1 材料56
• 1.1 主要试剂56
• 1.2 主要仪器56
• 2 方法56-57
• 2.1 GST-ORF3作为诱饵蛋白的GSTPull-down实验56-57
• 2.2 GST-RPS11作为诱饵蛋白的GSTPull-down实验57
• 3 结果57-59
• 3.1 GST-ORF3作为诱饵蛋白的GSTPull-down结果57-58
• 3.2 GST-RPS11作为诱饵蛋白的GSTPull-down结果58-59
• 4 讨论59-61
• 第五章 结论61-62
• 参考文献62-71
• 附录1 溶液配制71-73
• 附录2 缩略词表73-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表或录用的论文75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：286210