DNA甲基化参与克罗恩病穿透性肠黏膜病变的机制研究

发布时间：2020-10-30 15:05

　　 克罗恩病是一种慢性反复发作性肠道疾病,主要累及小肠末端和结肠起始部。肠道穿透性病变是克罗恩病常见的外科并发症,且病程严重复杂。然而,关于克罗恩病合并穿透性病变的研究多集中于克罗恩病合并肛周穿透性病变,较少涉及肠道穿透性病变。目前克罗恩病的病因尚不明确,主流观点认为克罗恩病是由遗传变异、肠道菌群、宿主免疫系统和环境因素等多重因素的复杂相互作用引起。而表观遗传学作为连接遗传因素与非遗传因素的重要环节,在克罗恩病的发病中势必起到重要作用。同时,克罗恩病穿透性肠黏膜病变的病因也尚不明确,普遍观点认为,这是感染或脓毒症引起的急性炎症的慢性结果,与深部黏膜溃疡的形成有关。但其中的具体机制与参与因素亦尚不明确。DNA甲基化作为表观遗传学中研究最为广泛的一个分支,或许可以从机制上解释这一复杂病变的产生。DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的催化下,将一个甲基共价连接到胞嘧啶的5号碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶。早期研究多关注克罗恩病外周血的DNA甲基化变化,仅有少量研究关注克罗恩病中的肠黏膜组织。而肠黏膜组织是人体内环境与外界环境和肠道菌群最直接的交流部位,且包含丰富复杂的肠道免疫系统,因此,克罗恩病肠黏膜组织的DNA甲基化状态更值得深究,同时或许可以为肠黏膜穿透性病变的机制探索提供新的思路。第一部分合并有肠道穿透性病变的克罗恩病的临床特征目的:本部分研究旨在通过分别对合并有肠道穿透性病变的克罗恩病与既无狭窄又无穿透性病变和单纯狭窄性病变的患者进行比较,分析该类患者的特殊临床特征。方法:回顾性地收集2010年9月至2014年8月南京大学医学院附属金陵医院普通外科收治的确诊克罗恩病患者共343名。根据蒙特利尔分类标准,将患者分为3组:肠道穿透性病变组(B3型),肠道狭窄性病变组(B2型)以及无肠道穿透性及狭窄病变组(B1和P型)。比较组间的人口学资料与临床相关数据。结果:肠道穿透性病变组患者接受肠道手术的比例显著高于肠道狭窄性病变组(82.2%vs.67.4%,P=0.015)和无肠道穿透性及狭窄病变组(82.2%vs.58.1%,P=0.000)。其中,肠道穿透性病变组患者接受回肠切除术的比例分别显著高于其余两组(43.3%vs.14.0%,P=0.000,43.3%vs.9.7%,P=0.019)。肠道穿透性病变组患者接受其他小肠切除手术(34.4%vs.20.2%,P=0.019)和回肠造口术(11.1%vs.1.6%,P=0.005)的比例显著高于无肠道穿透性及狭窄病变组。结论:合并有肠道穿透性病变的克罗恩病患者相较于其他类型的克罗恩病患者的肠道手术率明显升高。第二部分克罗恩病穿透性肠黏膜病变的差异DNA甲基化位点初筛目的:本研究的目的是利用最新的Infinium 850K DNA甲基化芯片,全面评估从成人克罗恩病患者的肠黏膜组织中全基因组DNA的甲基化改变,并与健康人的肠黏膜组织中DNA甲基化状态比较,筛选差异性DNA甲基化位点。方法:随机选择2016年11月在南京大学医学院附属金陵医院接受肠镜检查的克罗恩病患者7名。以年龄、性别为标准严格匹配7名健康人作为对照组。在克罗恩病患者穿透性病变部位和镜下正常部位分别取肠黏膜组织,为克罗恩病穿透组和克罗恩病非穿透组;健康人的肠黏膜组织则进入正常组。利用Infinium 850K DNA甲基化芯片分析甲基化异常位点。结果:比较克罗恩病穿透性肠黏膜组织与正常肠黏膜组织,共筛选出5200个差异性DNA甲基化位点。差异程度最大的位点包括:超甲基化位点(KCNJ13;GIGYF2,C7orf72 和 HLA-DRB1),去甲基化位点(HERPUD2,MUC1和TMTC2)。比较克罗恩病穿透性肠黏膜组织与非穿透性肠黏膜组织,共筛选出3237个差异性DNA甲基化位点。差异程度最大的位点包括:超甲基化位点(MTSS1,YPEL5,EFCAB11 和 CBLB),去甲基化位点(PLEKHG1,LINC01506和KIAA0753)。差异性DNA甲基化位点参与凋亡的正调控过程与白介素-8生成的正向调控过程,并富集于炎症性肠病相关的信号通路以及细胞外基质受体相互作用信号通路。结论:克罗恩病穿透性肠黏膜病变相关的DNA甲基化差异位点有C7orf72,HLA-DRB1,MUC1,YPEL5,CBLB等。凋亡过程,IL-8的生成以及ECM异常相关可能是参与克罗恩病穿透性肠黏膜病变的机制。第三部分克罗恩病穿透性肠黏膜病变的差异DNA甲基化位点的验证目的:本研究通过焦磷酸测序方法验证Infinium850K　DNA甲基化芯片的结果,揭示相关位点甲基化异常在克罗恩病穿透性肠黏膜病变过程中的作用。同时探究DNA甲基化程度变化与疾病活动度之间的关系。方法:选择在南京大学医学院附属金陵医院接受肠镜检查的克罗恩病患者25名,健康对照者7名。收集患者的年龄、性别、克罗恩病疾病活动度评分等资料。分别在克罗恩病患者和健康者的肠黏膜穿透性病变部位取肠黏膜组织。利用焦磷酸测序方法检测HLA-DRB1、MUC1、YPEL5和CBLB位点的甲基化异常程度。结果:克罗恩病组的肠黏膜组织相较于对照组,HLA-DRB1、YPEL5和CBLB位点的甲基化程度均显著升高,而MUC1位点的甲基化程度则显著降低。克罗恩病组的HLA-DRB1、YPEL5和CBLB基因的相对表达量均显著降低,MUC1基因的相对表达量则显著升高。相关性分析发现,4个位点HLA-DRBB1(r =-0.62,P0.001),MUC1(r =-0.45,P = 0.01),YPEL5(r =-0.55,P = 0.001)以及CBLB(r =-0.62,P0.001)的甲基化异常程度均与其相对表达量均成显著负相关。MUC1的甲基化异常程度与克罗恩病疾病活动度评分呈显著负相关(r =-0.50,P = 0.01)。结论:克罗恩病穿透性肠黏膜病变组织中发现HLA-DRB1、YPEL5和CBLB的甲基化程度异常升高,而MUC1的甲基化程度降低。MUC1的甲基化异常程度与克罗恩病疾病活动度呈负相关。
【学位单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R574.62
【部分图文】：

二、ＤＮＡ的鉴定??应用基因组试剂盒纯化获得２１个实验组与对照组样本的ＤＮＡ样品，通过??电泳检测，样品ＤＮＡ条带均清晰，无杂带及拖带（如图２．１所示）。且ＯＤ２６０／２８０??比值在１．７０－１．９０之间（见表２．３），说明ＤＮＡ纯度较髙。ＤＮＡ样品提取量充足。??图２．１?ＣＤ组与对照组样品ＤＮＡ纯化电泳图??注：最后一列为?ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，从上到下依次为?２０００ｂｐ、ｌＯＯＯｂｐ、７５０ｂｐ、５００ｂｐ、２５０ｂｐ、??ｌＯＯｂｐ。??４７??

四、ＣＤ穿透性、非穿透性肠黏膜组织与正常肠黏膜组织之间的ＤＮＡ甲基化差??异??（一）总体结果??１．?ＣＤ穿透性肠黏膜组织与正常肠黏膜组织比较??共筛选出５２００个差异性ＤＮＡ甲基化位点。其中超甲基化位点２９７８个，去??甲基化位点２２２２个。??２．?ＣＤ穿透性肠黏膜组织与非穿透性肠黏膜组织比较??共筛选出３２３７个差异性ＤＮＡ甲基化位点。其中超甲基化位点１１５７个，去??甲基化位点２０８０个。??

通过绘制火山图（图２．４），筛选超甲基化与去甲基化程度最高的若干位如下：??超甲基化位点：ＫＣＮＪ１３；ＧＩＧＹＦ２，Ｃ７ｏｒｆ７２?和?ＨＬＡ－ＤＲＢ１??去甲基ｆｔ位点：ＨＥＲＰＵＤ２，ＭＵＣ１?和?ＴＭＴＣ２??５
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本文编号：2862642