HBV核苷（酸）类似物多药耐药的检测和分析

发布时间：2020-11-01 03:19

　　 背景： 慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是我国发病率较高的传染病之一。CHB的治疗核心为抗病毒治疗。包括拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)、替比夫定(LdT)等在内的核苷(酸)类似物(Nucleos(t)ide analogs, NAs)因其口服给药方便,价格相对低廉等原因目前应用较为广泛。但是NAs仅能抑制病毒复制,不能彻底清除肝细胞核内的共价闭合环状DNA (Covalently closed circular DNA, cccDNA),故需长期用药。随着用药人数的增加,治疗时间的延长,NAs耐药问题逐渐凸现出来,尤其是多药耐药(Multi-drug resistance, MDR)患者的出现,临床处理十分棘手。克隆测序是研究病毒准种常用的方法,可以直观显示患者体内病毒的耐药基因变异模式,对研究多药耐药患者的基因变异特点、指导治疗具有重要意义。 目的： 1.建立稳定准确的克隆测序方法,结合直接测序法分析克隆测序法在多药耐药检测中的作用； 2.对多药耐药患者进行克隆测序检测,以明确患者的耐药基因变异模式,并对耐药基因变异特点与临床资料进行初步分析,为多药耐药的后续的实验室研究和临床治疗提供线索和依据。 方法： 1.筛集2008年6月-2009年9月于北京地坛医院就诊的CHB患者中发生多药耐药的患者。入选标准：符合2000年《病毒性肝炎防治方案》CHB诊断标准；患者正在接受单药或联合抗病毒治疗,并且出现治疗失败,经直接测序法检测诊断为核苷(酸)类似物(包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦或替比夫定)多药耐药。 2.用直接测序法确定患者属于多药耐药患者后,运用克隆测序的方法,从每位患者随机挑取约40个克隆,对菌液聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)及酶切鉴定阳性的单克隆进行测序,分析患者的基因型和耐药基因变异模式,并与患者既往的治疗策略及有无生化学突破、病毒学突破和病毒载量相结合进行分析。 结果： 1.8例患者及1例随访患者共9份标本经巢式PCR(nt-PCR)直接测序,证实全部为拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦或替比夫定多药耐药。 2.分析经菌液PCR、酶切鉴定双阳性并测序成功的237个单克隆,7例患者的多药耐药变异位点共存于同一病毒序列,1例患者的LAM耐药变异位点和ADV耐药变异位点分别存在于不同的病毒序列,且该患者的ADV耐药变异为原发性耐药。 3.9份标本及237个单克隆测序全部为基因C型。 4.发生LAM+ADV耐药的克隆所占比例最大,其次为ADV单药耐药及LAM+LdT耐药,患者的耐药基因变异模式以M204V+A181V+L180M及M204I+A181T为主。 5.单药换药治疗易发生多药耐药,在LAM换用ETV的患者中LAM、ETV耐药几率较高。 6.6例患者发生病毒学突破,病毒载量较高的患者对ADV+LAM耐药的基因突变主要为M204V+A181V+L180M,对LAM+ADV+LdT+ETV耐药的变异主要是M204I+T184I+ A181S+L80I; 2例患者在发生LAM+ADV耐药后换用LdT治疗的过程中发生病毒学突破,但检测结果均为M204V+A181V+L180M联合变异。 7.发生病毒学突破后病毒载量较高的患者及治疗过程中HBV DNA持续高于检测下限的患者中存在低比率的ETV、LAM或LdT原发性耐药位点。 8.发现了诸多新的耐药相关变异位点,对其临床意义尚需进一步验证。 结论： 1.多药耐药的变异位点多共存于同一病毒序列,也可分别存在于不同病毒序列,后者似与原发耐药有关。 2.发生LAM+ADV耐药患者的耐药基因变异模式以M204V+A181V+L180M及M204I+A181T为主。 3.单药换药治疗更容易发生多药耐药。 4.发生病毒学突破且病毒载量较高的患者,其耐药基因变异模式复杂。 5.患者体内可能存在低比率的原发性耐药变异株。 6.发现了诸多新的耐药变异位点,需体外实验进一步证实。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

4.克隆测序菌液PCR、酶切鉴定9份标本的第二轮PCR产物与pGEM一T-easy载体连接转化后，各挑取40个单克隆摇菌，取菌液PCR鉴定阳性(图4)及酶切鉴定阳性(图5)的单克隆送测序。图4菌液PCR鉴定n。指阴性对照，mZk指 DNAMarker2000，其中6，9，13号PCR阴性图5质粒酶切鉴定ZL指质粒对照，MZK指 oNAMarker2000，s00bp左右均有目的条带!0

4.克隆测序菌液PCR、酶切鉴定9份标本的第二轮PCR产物与pGEM一T-easy载体连接转化后，各挑取40个单克隆摇菌，取菌液PCR鉴定阳性(图4)及酶切鉴定阳性(图5)的单克隆送测序。图4菌液PCR鉴定n。指阴性对照，mZk指 DNAMarker2000，其中6，9，13号PCR阴性图5质粒酶切鉴定ZL指质粒对照，MZK指 oNAMarker2000，s00bp左右均有目的条带!0

8例患者共获得237个PCR、酶切鉴定双阳性并测序成功的单克隆。运用、乞 cforNTI10.0软件逐一分析每位患者各克隆的变异情况， vectorNTI10.0软件的Allg”x程序对测序结果进行比对，分析每位患者众多克隆中各变异位点的总体情况如图6，黄色区域代表各个克隆株中一致的基因序列，蓝白区域代表存在异质性的基因序列，其中蓝色代表占主要比例的碱基。经分析7例患者其多药耐药基因变异位点存在于同一病毒序列，只有1例患者LAM耐药相关变异和ADV耐药相关变异分别存在于不同的病毒序列。另外还发现了许多直接测序法未检测到的变异位点，例如615、735及893号患者发现恩替卡韦相关M25oV变异，893、1059及1084号患者发现阿德福韦酷相关N2365变异等。破破 }}}沁‘物创璐肠的，的，10，劫”O
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本文编号：2864958