Taurine、EGCG和Genistein联合调控AMPK-mTOR通路抑制肝星状细胞自噬抗大鼠肝纤维化的研究

发布时间：2020-11-01 07:25

　　 目的在Taurine、EGCG和Genistein联合用药作用大鼠肝星状细胞及肝纤维化大鼠后,通过监测细胞自噬的变化情况,分析自噬的信号调控机制,探讨自噬与联合用药抗大鼠肝纤维化的关系。以阐明联合用药抑制细胞自噬从而抗大鼠肝纤维化的分子机制,为药物的临床应用奠定一定的药理基础。并期待发现新的肝纤维化发生发展参与因子或调控因子,为肝纤维化的治疗提供新的思路。方法1.联合用药抑制大鼠肝星状细胞自噬的细胞水平研究:(1)以HSC-T6为研究对象,分为对照组、联合药物组、自噬抑制剂Bafilomycin-A1组和联合药物+自噬抑制剂组。在联合用药作用大鼠肝星状细胞后,通过CCK-8法测定细胞活力及存活率。(2)应用透射电镜和吖啶橙荧光染色技术检测细胞自噬体、自噬溶酶体的状态(3)通过Western blot分析自噬标志蛋白LC3及Beclin-1的表达变化(4)通过mRFP-GFP-LC3慢病毒转染HSC-T6标记追踪LC3蛋白,以监测细胞自噬动态变化。2.联合用药抑制大鼠肝星状细胞自噬的动物水平研究:(1)以CCl_4诱导肝纤维化模型的SD大鼠进行实验,分对照组、CCl_4模型组、联合药物组、自噬抑制剂3-MA组和联合用药+自噬抑制剂组。检测各组大鼠血清中ALT和AST水平,采用HE染色及Masson染色分析各组大鼠肝纤维化程度。(2)通过透射电镜观测大鼠肝组织细胞的自噬体及自噬溶酶体的状态。(3)采用Western blot和IHC技术分析大鼠肝组织自噬标志蛋白LC3及Beclin-1的表达。3.联合用药抑制大鼠肝星状细胞自噬的信号调控机制研究:(1)以联合用药作用大鼠肝星状细胞,通过qPCR和Western blot技术分析AMPK-mTOR信号通路上关键因子AMPK和mTOR等的mRNA、蛋白表达水平及磷酸化水平,并检测细胞的增殖、肝纤维化相关因子TGF-β1、COL-Ⅰ的表达,以分析AMPK-mTOR信号通路在联合用药抗大鼠肝纤维化中的调控作用。(2)采用AMPK-mTOR通路的抑制剂Compound C干预大鼠肝星状细胞,再应用联合用药作用细胞,观察细胞的活力及存活率,检测LC3、Beclin1表达水平以及AMPK通路关键因子AMPK和mTOR磷酸化水平,以分析AMPK-mTOR通路参与的联合用药抑制大鼠肝星状细胞的自噬调控。结果1.联合用药抑制大鼠肝星状细胞自噬:(1)透射电镜观察发现,活化HSCs中的自噬体数量明显多于正常肝脏细胞,在联合药物作用之后,HSCs中自噬体数量显著减少。(2)CCK-8检测HSCs存活率表明,联合药物和自噬抑制剂Bafilomycin-A1均能明显抑制HSCs增殖。(3)吖啶橙染色实验中,对照组HSCs的红色荧光区域格外明显,细胞形态完好,联合药物+自噬抑制剂组细胞只有微弱的红色荧光。(4)Western blot分析发现联合药物处理HSCs后,自噬标志性蛋白LC3-II和Beclin1表达量明显降低。(5)以自噬抑制剂Bafilomycin-A1为对照,联合药物和Bafilomycin-A1作用细胞后,联合药物+Bafilomycin-A1组LC3-II的表达量明显小于Bafilomycin-A1组,说明联合药物能进一步减少自噬体的合成。mRFP-GFP-LC3双荧光结果显示,与对照组相比,其他三组细胞出现明显绿色荧光,其中联合药物+Bafilomycin-A1组绿色荧光最强,Merge图像显示联合药物组细胞荧光颜色偏绿,进一步证明联合药物能抑制HSCs细胞自噬体的生成。2.联合用药抑制肝纤维化大鼠的肝脏组织自噬:(1)CCl_4处理大鼠8周之后,血清中的AST和ALT水平明显升高,联合药物处理之后,逐渐恢复到正常水平。(2)HE和Masson染色显示,与正常组相比,模型组大鼠肝细胞浊肿变性,假小叶形成,结节周围结缔组织增生沉积出现交错复杂的蓝绿色网状条纹,联合药物处理之后,汇管区纤维组织增生减少,纤维间隔变窄,炎脂肪空泡形成明显减低。(3)收集大鼠肝脏组织,在透射电镜下观察,与正常大鼠肝脏组织相比,肝纤维化模型组大鼠肝脏中出现大量的自噬体,联合药物处理之后,自噬体数量明显减少。(4)Western blot和IHC实验结果显示,与正常组相比,肝纤维化大鼠中LC3-II和Beclin1的表达量显著增加,联合药物处理后LC3-II和Beclin1表达量明显降低。3.联合用药对肝星状细胞自噬信号通路的调控:(1)qPCR检测结果显示,与对照组相比,联合药物显著抑制HSCs内LC3、Beclin1、AMPK和mTOR基因mRNA水平的表达。其中,与Compound C组相比,联合药物+Compound C组中以上四个基因表达显著降低。(2)Western blot结果显示,联合用药干预HSCs之后p-AMPK表达降低,同时p-mTOR的表达升高。结论:1.联合用药抗大鼠肝纤维化作用与肝星状细胞的自噬紧密相关。活化的肝星状细胞和肝纤维化模型大鼠肝脏中出现大量自噬体,而联合药物能干预细胞的自噬,促使自噬体数量减少,细胞的增殖受抑制,同时联合药物降低自噬标志性蛋白LC3和Beclin1的表达。由此可见,联合药物抗大鼠肝纤维化的部分机理可能是通过调节细胞的自噬,影响细胞的增殖从而达到抗肝纤维化的目的。2.联合药物通过阻碍肝星状细胞AMPK-mTOR信号通路抑制肝星状细胞自噬。联合药物干预肝星状细胞后,AMPK-mTOR信号通路中的关键因子LC3、Beclin1、AMPK和mTOR的基因、蛋白及磷酸化蛋白的表达部分显著降低,肝纤维化因子TGF-β1和Col-1的表达也同时下降。我们推测联合药物抗肝纤维化的分子机制之一,可能是联合药物能抑制活化的HSCs中的AMPK-mTOR信号通路,致使细胞中的自噬进程受阻,而活化的HSCs没有能量供给无法继续增殖,从而达到抗大鼠肝纤维化作用。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

The viability of HSCs treated with TEG, Baf-A1 and TEG+Baf-A1. M***P<0.001vs Control, **P<0.01vs TEG+Baf-A1.图 2 联合药物、自噬抑制剂对 HSCs 增殖的影响染色观察联合药物对 HSCs 自噬溶酶体的影响结合双链 DNA 时细胞核显示绿色荧光，而在低应时发出红色荧光。本实验结果发现，对照组中细胞形态完好；但是联合药物组和 Baf-A1 组只有淡出现皱缩和变圆等不正常形态，这说明联合药殖具有阻碍作用，同时联合药物会抑制肝星状细见图 3

gure 3. Effect of autophagy of TEG and Baf-A1 in HSCs by fluorescence microscopy after stainedacridine orange.图 3 吖啶橙染色后荧光显微镜下观察 HSCs 细胞自噬A: Control 组 B: TEG 组 C: Baf-A1 组 D: TEG+ Baf-A1 组 Western blot 分析联合药物对 HSCs 中 LC3-II 和 Beclin1 表达的影响联合药物作用 HSCs 细胞 24h 后，对照组、TEG 组、Baf-A1 组G+Baf-A1 组中的 LC3-II 的相对表达量分别为：1.5±0.13、1.1±0.08±0.29、2.31±0.23（P＜0.01），差异具有统计学意义。由数据结果可对照组相比，TEG 组中 LC3-II 的表达量显著降低，Baf-A1 组中 LC表达量却显著高于 TEG+ Baf-A1 组，而 TEG+ Baf-A1 组 LC3-II 的表于 TEG 组和 Baf-A1 组之间，可见 TEG 能抑制 HSCs 中自噬体合成

32igure 4. The protein levels of LC3-II in the HSCs treated with TEG, Baf-A1, and TEMean±SD. n = 3. *P<0.05vs Control, **P<0.01vsTEG.图 4 TEG 对肝星状细胞的 LC3-II 蛋白水平的影响A: TEG 组 B: Baf-A1 组 C: TEG+Baf-A1 组 D: Control 组
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本文编号：2865208