HBx蛋白通过调控原代小鼠肝细胞周期促进HBV复制的分子机制研究

发布时间：2020-11-03 14:09

　　 背景和目的：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）编码的HBx蛋白是一种多功能调节蛋白，它与HBV复制水平和HBV相关性原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的发生和发展密切相关，但其具体调控机制尚未完全阐明。目前研究发现在永生化和转化细胞系中，有效的HBV复制依赖于HBx蛋白，其中HBx蛋白的羧基端具有关键作用。但在正常肝细胞中，HBx通过何种途径调控HBV的复制、如何影响细胞增殖途径以及其作用的确切功能区尚不清楚。本课题以正常原代培养小鼠肝细胞为研究对象，探讨HBx蛋白及其截短体对细胞周期和HBV复制水平的影响及其相互关系，并确认HBx发挥上述作用的主要功能区，以揭示HBx蛋白参与调控细胞周期和HBV复制的分子机制。 方法： （1）运用改良的原位两步胶原酶灌流法对C57BL/6小鼠肝细胞进行分离纯化，采用含多种添加物的无血清WME培养基对小鼠肝细胞进行原代培养，过碘酸雪夫氏（Periodic acid-Schiff′s，PAS）染色、生化法鉴定肝细胞的功能和分化特性，免疫蛋白印迹（Western blot）法检测新鲜分离和原代培养肝细胞的细胞周期标志物p16、p21、cyclinD1、cyclin E、cyclin A的表达水平。 （2）利用HBx及其截短体表达质粒pSI-HA-X、pSI-HA-X~(1-101)、pSI-HA-X~(43-154)，瞬时转染原代培养小鼠肝细胞，免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）/Western blot法检测HBx蛋白表达水平。Western blot法检测细胞上述周期标志物表达水平。 （3）利用编码HBV全基因组1.2倍体（payw1.2）的pGEM-HBV质粒和HBx缺失突变的相同质粒pGEM-HBV△X瞬时转染原代培养小鼠肝细胞，将pSI-HA-X、pSI-HA-X~(1-101)、pSI-HA-X~(43-154)分别与pGEM-HBV△X共转染细胞，IP/Western blot法检测HBx蛋白表达水平，Western blot法检测细胞上述周期标志物及HBV编码蛋白HBc的表达，Southern印迹杂交（Southern blot）及实时荧光定量PCR检测HBV复制水平。 （4）利用特异性沉默p53基因的miRNA干扰质粒分别与pGEM-HBV和pGEM-HBV△X共转染原代培养小鼠肝细胞， IP/Western blot法鉴定p53沉默效率，Western blot法检测细胞上述周期标志物及HBV编码的HBc蛋白的表达，Southern印迹杂交（Southern blot）和实时荧光定量PCR法检测HBV复制水平。 结果： （1）原代培养的小鼠肝细胞能保持合成白蛋白、尿素、糖原的肝脏特异性功能和分化特性，并能维持与新鲜分离肝细胞相同的静息细胞周期（G0期）状态。 （2）在转染后原代培养小鼠肝细胞中IP/Western blot法能检测到全长HBx蛋白及其羧基端截短体HBx1-101、氨基端截短体HBx~(43-154)的表达，全长HBx与HBx~(43-154)的表达水平相当，而HBx1-101的表达水平明显低于前两者。全长HBx与HBx~(43-154)能下调p16的表达水平，上调p21、cyclin D、cyclin E的表达水平，对cyclin A的表达水平无影响，HBx~(1-101)对上述细胞周期标志物的表达水平均无影响。在增加pSI-HA-X~(1-101)质粒转染量以提高HBx~(1-101)蛋白表达水平之后，对细胞周期标志物的表达仍无影响。 （3）与pGEM-HBV△X组细胞相比， pGEM-HBV组细胞内p16的表达下调，p21、cyclin D、cyclin E的表达上调，cyclin A的表达水平无明显变化，且核心颗粒HBV DNA水平明显高于pGEM-HBV△X组细胞。分别以全长HBx和HBx43-154重建pGEM-HBV△X缺失的HBx蛋白表达之后，其各项细胞周期标志物的表达和核心颗粒HBV DNA均能够恢复到与pGEM-HBV组细胞相似的水平，但即使增加pSI-HA-X~(1-101)质粒转染量以使HBx~(1-101)蛋白表达水平与全长HBx和HBx~(43-154)相当，pGEM-HBV△X组细胞内细胞周期标志物的水平和核心颗粒HBV DNA水平仍然没有明显改变。HBV编码的HBc蛋白水平在各组细胞中一致。 （4）转染pGEM-HBV△X的细胞中，沉默p53基因的表达使p16表达下调，cyclin D1、cyclin E、cyclinA表达上调，对p21的表达水平无影响，并能使其核心颗粒HBV DNA水平上升，但不能达到与pGEM-HBV组细胞相当的水平。转染pGEM-HBV的细胞中，沉默p53基因的表达对其细胞周期标志物水平及核心颗粒HBV DNA水平均无明显影响。HBV编码的HBc蛋白水平在各组细胞一致。 结论：在保持静息细胞周期状态的原代培养小鼠肝细胞中，HBx蛋白通过下调p16的表达，上调cyclin D、cyclin E的表达，使细胞从G0期进入G1期，且通过上调p21的表达，使细胞停滞在G1期，并由此促进HBV的复制。HBx蛋白能通过上调p21的表达拮抗内源性p53基因沉默导致的细胞周期向S期推进，从而促进HBV的复制。原代培养小鼠肝细胞中HBx蛋白是维持HBV有效复制水平的关键因素，HBx的羧基端是HBx通过调控细胞周期进程促进HBV复制的重要功能区。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R735.7;R512.62
【文章目录】：
英汉缩略语名词对照
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 维持静息细胞周期的原代小鼠肝细胞的分离培养及鉴定
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    参考文献
第二部分 HBx 蛋白及其截短体对原代培养小鼠肝细胞周期标志物水平的影响
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    参考文献
第三部分 HBV 复制背景下全长 HBx 蛋白及其截短体对细胞周期和 HBV 复制水平的影响及其相互关系
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    参考文献
第四部分 沉默 p53 表达对 HBx 蛋白促进 HBV 复制的影响
    1 材料与方法
    2 结果
    3 讨论
    参考文献
全文总结
文献综述
    参考文献
致谢
博士期间发表的论文

【参考文献】

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1 严少南,邓斌,龚作炯;肝癌细胞系HepG2细胞周期与端粒酶活性及HBV复制的关系[J];癌症;2003年05期

本文编号：2868680