髓样细胞表达激发受体-1（TREM-1）在小鼠重症急性胰腺炎中的表达及分子治疗应用

发布时间：2020-11-05 16:51

　　 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一种病因复杂,发病机制不明,临床常见的急腹症,其病情凶险,预后不良,治疗棘手,并发症多,目前病死率仍高达20-30%,有关其治疗方法的探索一直是研究的热点。 目前临床上已有通过检测C反应蛋白和降钙素原等来判断SAP炎预后,但是应用价值非常有限。SAP的一个重要问题是尚没有一个特异的血清学或者其他指标来诊断和预测预后,进而指导治疗。 髓样细胞表达的激发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM)属免疫球蛋白超家族。TREM-1首次发现是在2001年,加深了人们对炎症反应启动和发展过程的认识。其主要表达于中性粒细胞、成熟单核细胞和巨噬细胞等天然免疫反应的效应细胞,选择性地表达于肺泡、肠液及其他体液的吞噬细胞上。TREM-1在众多炎症反应参与的疾病(包括感染性和非感染性炎症反应、肿瘤等)中均有表达。TREM-1能促进小鼠促炎因子分泌,诱导中性粒细胞和单核细胞分泌中性粒细胞趋化因子,如IL-8、单核细胞趋化蛋白(MCP-1、MCP-3)及巨噬细胞炎症反应蛋白-1α(MIP-1α)。TREM-1的激活能导致中性粒细胞迅速脱颗粒、呼吸爆发及吞噬作用。Toll样受体(TLR)-2或TLR-4与配体识别后可激活TREM-1,促进大量致炎细胞因子的释放,同时抑制IL-10的释放。TREM-1与这些下游细胞因子形成一个正反馈的自分泌调节回路,促使炎症反应增强放大。同时,通过磷脂酰肌醇-3激酶依赖途径,激活TLRs可促进TREM-1的表达。TLR可能通过激活NF-κB,来调节TREM-1的表达；而TREM-1同样可以激活多种转录复合物,协同NF-κB促进促炎因子基因的转录。这些研究结论显示,TREM-1和TLR共同介导炎症反应。TREM-1介导的信号转导通路在炎症反应的级联放大和脓毒症的发生中起着关键性的作用。Gibot等人分别构建了小鼠脓毒症模型和Wistar大鼠脓毒症模型,分别合成了类似小鼠和大鼠TREM-1胞外区部分合成肽段,在小鼠脓毒性休克模型里,小鼠胞外区合成肽可以保护内毒素血症小鼠免于死亡,而在大鼠模型中,利用合成大鼠胞外区肽段治疗,发现可以改善血流动力学状态,减轻乳酸酸中毒症状,调节TNF-α、IL-1β等促炎因子的释放,提高生存率。研究结果显示,胞外区肽段可能成为脓毒症治疗的有效靶标。 本课题拟通过小鼠SAP模型,分析TREM-1 mRNA水平的表达以及使用免疫组化的方法检测TREM-1蛋白水平的表达,评估其在SAP病程中的作用；构建小鼠TREM-1-IgG融合蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中大量表达并纯化出小鼠TREM-1融合蛋白,对其进行优化,取得较高纯度蛋白,用于治疗小鼠SAP,验证TREM-1作为SAP分子治疗靶点的价值,从而为更深入了解TREM-1的信号转导机制,为明确TREM-1能否作为各种疾病的诊断标志和治疗靶点提供依据,为探索相关疾病新的治疗方法提供线索。 一、TREM-1在小鼠SAP的表达 目的：检测小鼠SAP胰腺组织TREM-1的表达 方法：50只雄性昆明小鼠随机分为5组,用生理盐水配置20%L-精氨酸利用腹腔注射的方法,按照4g／kg的剂量,间隔一小时重复注射一次,制备SAP模型。对照组昆明小鼠,腹腔注射生理盐水,造模后24h,48h,72h,96h分批处死小鼠,心脏采血,同时留取胰腺,肝脏,肺脏组织。测定淀粉酶,肌酐和谷丙转氨酶,观察各组小鼠胰腺等组织病理学变化并评分；并以RT-PCR, real-timePCR的方法检测外周血白细胞及胰腺组织TREM-1 mRNA表达；免疫组化法检测小鼠胰腺组织中TREM-1蛋白表达。 结果：血清淀粉酶检测和组织病理学结果,证实造模成功。各组小鼠按照时间点处置,无菌操作下留取胰腺组织,抽提总mRNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出小鼠TREM-1,扩增产物与预期目的基因一致,回收纯化产物送检测序,测序结果与GenBank公布的序列同源性100%。进行real-timePCR相对定量检测,统计结果显示TREM-1 mRNA表达量随着病程进展在各组小鼠胰腺组织中发生变化。免疫组化结果显示TREM-1蛋白在SAP小鼠的胰腺组织存在表达。 结论：TREM-1的相对表达量在SAP小鼠病程中逐渐升高,48h升至顶峰,后逐渐下降,提示TREM-1在SAP的发生发展中有一定作用。 二、TREM-1-IgG重组融合蛋白原核表达载体的构建、表达、纯化和鉴定 目的：构建小鼠TREM-1-IgG重组融合蛋白的原核表达载体,大量表达融合蛋白,纯化后进行鉴定。 方法：利用限制性内切酶位点EcoR I, BamH I和Xho I,双酶切表达载体pMD18-T; pMD18-T/小鼠TREM-1胞外区质粒经EcoRI/BamHI双酶切；pMD18-T/人IgG-Fc质粒经BamH I/Xho I双酶切；酶切后的三片段由T4DNA ligase连接,连接产物应用CaCl2法转化E.coli DH5α感受态细胞,抽提鉴定重组质粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG。选择自构建载体pet-28a-His-sumo为表达载体,从pGEX4T-1/小鼠TREM-1-IgG质粒上PCR扩增目的片段,BglⅡ/XhoⅠ双酶切后的片段接入到pet28a-His-sumo,构建表达重组蛋白的原核表达质粒pet28a/小鼠TREM-1-IgG。经测序鉴定无误。阳性克隆转入BL21以后,IPTG诱导表达蛋白,同时优化表达条件,使用His-affinity-resin层析柱纯化；初步纯化后的融合蛋白为小鼠TREM-1-IgG(含载体上SUMO蛋白),应用SUMO蛋白酶酶切去除SUMO。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE及Western-Blot来鉴定表达产物。 结果：重组质粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG原核表达载体构建后,经转化入E.coli DH5a后质粒进行双酶切,RT-PCR扩增后行酶切,获得原质粒和目的基因的两条特异性条带,并经测序鉴定。SDS-PAG及Western-Blot分析证实表达产物为TREM-1融合蛋白。更换载体进行蛋白优化,使用SUMO蛋白酶将初步纯化后的表达产物去除SUMO,获得纯化后TREM-1融合蛋白,行SDS-PAGE和Western Blot检测,证实为目的蛋白。 结论：成功构建了小鼠TREM-1重组融合蛋白的原核表达载体,对表达产物进行蛋白优化过程,通过SAS-PAGE和Western-Blot检测,证实为目的蛋白。 三、TREM-1融合蛋白对SAP小鼠的治疗作用 目的：观察TREM-1融合蛋白对SAP小鼠的治疗作用 方法：70只昆明种小鼠,每只经腹腔注射精氨酸构建SAP模型后,随机将其分为7组,一组和二组为TREM-1融合蛋白治疗组,造模后6小时经尾静脉注射TREM-1融合蛋白,给药浓度为8mg/kg,三组和四组为阳性对照组,七组为阴性对照组。采用目前临床上治疗SAP的药物乌司他丁,给药浓度为10万U／kg,五组和六组为SAP对照组,以生理盐水静脉注射。一、三、五组分别在造模后24h处死,二、四、六组分别在造模后72h处死。检测外周血中炎症因子的表达,病理分析胰腺和肺脏的损伤情况,评估TREM-1重组融合蛋白的治疗作用。同时免疫组化半定量观察疗效。 结果：TREM-1融合蛋白治疗组可显著提高生存率(P0.05)；病理学结果示TREM-1融合蛋白治疗组较SAP对照组在胰腺及肺脏的水肿出血,炎症,坏死明显减轻(P0.05)；血清中炎症因子(sTREM-1, MIP-1α和超敏CRP)含量显著低于SAP对照组(P0.05)；免疫组化结果证实TREM-1融合蛋白24h治疗组的胰腺及肺脏组织中NF-KB阳性率及染色强度较SAP对照组显著降低(P0.05)；与乌司他丁治疗组疗效相当(P0.05)。 结论：TREM-1重组融合蛋白能有效缓解SAP小鼠的炎症反应,减轻胰腺、肺脏组织损害,降低血清中炎性因子含量。 通过上述研究,本课题得出以下结论： 1、TREM-1参与了SAP发生发展过程中的炎症反应,外周血TREM-1含量在SAP小鼠病程中逐渐升高,48h升至顶峰,后逐渐下降。 2、成功构建了小鼠TREM-1融合蛋白的原核表达载体,大量表达并纯化出小鼠TREM-1重组融合蛋白；并经鉴定证实为目的蛋白。 3、TREM-1融合蛋白能有效缓解SAP小鼠的炎症反应,减轻胰腺、肺脏组织损害,提高生存率,动物实验初步证实TREM-1作为分子治疗靶点可能是SAP治疗的一个新选择。 小结：本研究通过动物模型初步证实TREM-1在SAP小鼠中表达,同时构建载体,表达并纯化获得小鼠TREM-1重组融合蛋白,观察TREM-1重组融合蛋白对SAP小鼠的治疗作用,通过ELISA方法检测血清中TREM-1,CRP, IL-1β,MIP-1α等炎症因子,以及组织病理变化来观察疗效,了解TREM-1与各种炎症因子的相互作用,初步证实了TREM-1作为小鼠SAP分子治疗靶点的价值。为SAP患者外周血sTREM-1含量检测在临床的应用和后续寻找鉴定TREM-1的天然配体奠定了基础。为SAP发病机制的探讨和分子靶向治疗提供新的思路。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R576
【部分图文】：

血清谷内转氨酶的检测结果

4h胰腺(xzoos

第二军医大学硕士学位论文大量中性粒细胞。48h、72h、96h出血明显，肺泡间质明显增宽，大部分肺泡和间质有中性粒细胞浸润，结构损害较重。(图1一12)显微镜下观察肝脏:出血、炎症、坏死不明显，各组之间无明显差别。图(l一13)对各组病理变化按照方法中的评分标准进行病理评分，利用SPSS13.0对数据进行统计分析，各组胰腺组织随着病程进展，炎症坏死加重(P<0.05)。
【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 凌颖;SAP合并急性肺损伤的机制及地塞米松的防治作用研究[D];川北医学院;2012年

本文编号：2871916