人食管下括约肌多巴胺受体的表达规律

发布时间：2020-11-07 11:38

　　 目的:人食管下括约肌(LES)是位于食管胃连接部特殊增厚的环形肌,其宽度约2-3cm。Liebermann-Meffert等首次提出人LES由位于胃小弯侧呈半环形的钩状纤维(clasp fibres)和位于大弯侧呈斜行分布的套索纤维(sling fibres)共同构成,这两束肌纤维与膈脚一起在食管胃结合部形成高压带,维持LES的关闭状态,使LES形成一种类似单向阀门的结构。正常状态下,由于LES的持续性收缩使胃内容物不能反流入食管,另一方面,由于LES的适时舒张允许了食物继续下行入胃,或呕吐和打嗝,使胃内的液体或气体反流如食管并经口腔排出。LES的收缩和舒张功能调节机制非常复杂,包括了神经系统、体液因素及自身肌源性等多种因素。多巴胺(DA)受体作为G蛋白偶联受体家族重要的受体类型之一,广泛存在于哺乳动物的中枢及外周神经系统,并发挥着重要的作用。到目前为止已经发现它有D1R-D5R五种亚型,通过对腺苷酸活化酶活性的调节,可以实现不同部位平滑肌的收缩与舒张。按照其亚型对腺苷酸活化酶活性的不同作用,又将DA受体分为两大类即D1样受体(D1R、D5R)和D2样受体(D2R、D3R、D4R)。D1样受体激活腺苷酸活化酶活性,而D2样受体降低激活腺苷酸活化酶活性。但目前国内外对人LES受体类型及其分型以及调节机制的研究,主要局限于胆碱能受体,对于DA受体的研究则相对甚少。现有的对食管粘膜DA受体的研究也 主要是针对动物(负鼠等),与人有着种属,生理学的差异,对于人LES的DA受体的表达规律及调节机制的相关研究则未见报告。本试验采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western-blot)研究人LES的DA受体的5种亚型在套索纤维、钩状纤维、食管环行肌和胃底环行肌中mRNA、受体蛋白的表达规律,为进一步研究DA受体在人LES调节机制中的作用奠定基础,从而更为完善的阐述人LES调节机制,为食管运动功能障碍性疾病的临床治疗提供理论依据。 方法: 1选取2007年12月到2008年10月在我院因高位食管中段癌行食管大部切除术患者30例,其中男性23例,女性7例。手术室采集新鲜食管胃连接部手术标本,锐性剥去胃贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层后,制备套索纤维(S)、钩状纤维(C)、食管体部环行肌(E)和胃底环行肌(G)的肌条; 2按照1ml Trizol/100mg标本的比例加入Trizol,4℃条件下用组织匀浆器加充分研磨组织,然后依次通过氯仿萃取,异丙醇沉淀和75%乙醇的洗涤作用最终制备出组织RNA。DEPC水溶解,经紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度和完整性之后,应用5种DA受体亚型的引物行RT-PCR,检测其mRNA在4种肌条的表达,经Gel Pro软件分析扩增产物的光密度值(IOD),并计算DA受体亚型与β-actin IOD的比值表示mRNA的相对含量; 3按照100ul TBS /10mg标本的比例加入TBS, 4℃条件下用组织匀浆器加入TBS液匀浆,匀浆液(4℃,1000×g)离心10分钟。弃上清后,以美国PIERCE公司的膜蛋白提取试剂盒制备膜受体蛋白,考马斯亮蓝G-250定量,调整蛋白至相同浓度后,应用电泳仪电泳,分离出与5种DA受体亚型的分子量大小相应的蛋白后转膜,最后应用DA受体亚型抗体行Western blot检测蛋白的表达,并分析IOD值。 结果: 1 RT-PCR经紫外分光度计测定,提取的总RNA A260/A280的值是1.8-1.9;1%琼脂糖凝胶电泳显示,28S带的宽度及亮度是18S带的两倍。内参照β-actin在838bp处亮度均匀,在各反应中,扩增结果基本一致。有3种DA受体亚型mRNA在各肌条中均有表达,分别是D1R,D2R,D5R,扩增产物的长度与预计的一致,分别为455、279、363bp。相同肌条不同DA受体亚型与β-actin IOD比值有统计学差异(F=5741.75,p=0.00),两两比较3种受体亚型mRNA表达从强到弱顺序依次为D_1R,D_5R,D_2R,相同的受体亚型不同的肌条间mRNA的表达无统计学差异。另外两种受体亚型D_3R,D_4R的mRNA在四种肌条中均无表达。 2 Western blot3种DA受体亚型有其相应蛋白条带的表达,分别是D_1R,D_2R,D_5R,分子量分别为51、51、53。相同肌条不同受体亚型蛋白表达的IOD值有统计学差异(F=8453.308,p=0.00),两两比较3种受体亚型蛋白表达从强到弱的顺序为D_1R,D_5R,D_2R。相同受体在个肌条间没有蛋白表达的差异另外两种受体亚型D_3R,D_4R的蛋白在四种肌条中均无表达。 结论: 1有3种DA受体亚型mRNA在各肌条有表达,分别是D_1R,D_2R,D_5R,其中D1R表达量最高,其它依次是D_5R,D_2R;相同受体在各肌条间mRNA的表达无差异;D3R,D_4R的mRNA在四种肌条中均无表达; 2有3种DA受体亚型有其相应蛋白条带的表达,D_1R表达量最高,其它依次是D_5R,D_2R;相同受体在各肌条间蛋白的表达无差异;D_3R、D_4R的蛋白在四种肌条中均无表达。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R571
【文章目录】：
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研究论文 人食管下括约肌多巴胺受体的表达规律
    前言
    材料与方法
    结果
    附图
    附表
    讨论
    结论
    参考文献
综述 消化道多巴胺受体的亚型分布及其功能
    参考文献
致谢
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1 高立平;刘俊峰;温士旺;;胃泌素和胃动素对人离体食管下括约肌张力的调节机制[J];基础医学与临床;2006年03期

2 周俊,段丽萍,叶嗣懋,韩亚京,白若韵,林三仁;多巴胺受体亚型D_4和D_5在人胃、十二指肠的定位及表达[J];中华消化杂志;2003年07期

3 高立平;刘俊峰;温士旺;田子强;季保庆;王其彰;;胆囊收缩素受体对人食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的调节机制[J];中华实验外科杂志;2006年04期

4 温士旺;刘俊峰;高立平;田子强;王其彰;李保庆;;一氧化氮介导人食管下括约肌舒张的作用机制[J];中华医学杂志;2006年01期

本文编号：2873893