lnc-Scarna10过表达诱发肝纤维化的机制研究

发布时间：2020-11-07 16:42

　　 多种慢性肝病如病毒性肝炎、血吸虫病、自身免疫性肝病等可导致肝纤维化形成。随着病情的持续发展,会引起肝硬化、肝衰竭和死亡。近年来,随着对长链非编码RNA(long noncoding RNA;lnc RNAs)研究的不断深入,lnc RNAs广泛参与多种生物学功能和病理过程,如在发育、增殖、凋亡、分化和癌变等过程中发挥重要作用,但其在肝纤维化发生发展过程中的作用研究还不是很多。在本研究中,我们旨在通过基因芯片筛选出在肝纤维化过程中异常表达并具有人鼠同源性的lnc RNAs;通过检测肝纤维化、肝硬化患者血清标本及肝组织标本中lnc RNAs的表达水平明确lnc RNAs与肝纤维化的关联,阐明lnc RNAs可以作为肝纤维化的早期临床诊断标志物;并通过体内外实验揭示其在肝纤维化中发挥的作用及其机制,为肝纤维化的诊断治疗提供实验基础和治疗靶点。方法1.构建肝纤维化小鼠模型,通过观察实验组小鼠和对照组小鼠的肝脏外观、羟脯氨酸含量测定技术、HE染色和天狼猩红染色、Western blot、q RT-PCR、免疫组化等技术验证肝纤维化小鼠模型构建成功。2.应用基因芯片技术筛选出10个在肝纤维化中异常表达的lncRNAs,并通过KEGG Pathway分析、GO分析、同源性分析以及邻近基因分析,筛选出一个在肝纤维化过程中过表达并具有人鼠同源性的lnc RNA即lnc-SCARNA10(ENSMUST00000158992)。3.在小鼠肝细胞系AML12细胞以及小鼠原代HCs中通过c DNA末端快速扩增(RACE)实验技术检测小鼠lnc-Scarna10的全长序列,并通过核浆分离提取RNA技术确定lnc-Scarna10在细胞浆和细胞核中的定位。4.在小鼠肝细胞系AML12细胞、小鼠原代HCs中检测lnc-Scarna10的表达;在正常人、肝纤维化患者、肝硬化患者的血清标本和肝组织标本中检测lnc-SCARNA10的表达,验证lnc-SCARNA10是否具有作为肝纤维化临床诊断标志物的潜能;在正常小鼠和肝纤维化模型小鼠的原代HCs中检测lnc-Scarna10及纤维化相关基因和炎症相关基因的表达;在TGFβ处理的小鼠肝细胞系AML12细胞和小鼠原代HCs中检测lnc-Scarna10、纤维化相关基因、炎症相关基因以及凋亡相关基因的表达变化。5.构建干扰lnc-Scarna10的慢病毒载体,病毒转染小鼠肝细胞系AML12细胞和小鼠原代HCs后,通过q RT-PCR、Western blot检测lnc-Scarna10、纤维化相关基因、炎症相关基因和凋亡基因的表达变化。6.构建胆管结扎(BDL)诱导的小鼠肝纤维化模型,通过小鼠鼠尾静脉注射干扰lnc-Scarna10的慢病毒载体证实lnc-Scarna10在肝纤维化发生发展中的作用。7.在小鼠肝细胞系AML12细胞、小鼠原代HCs中干扰或过表达lnc-Scarna10后,通过q RT-PCR、Western blot检测芯片结果中提示的与肝纤维化发生密切相关的TGF-β信号通路。结果1.本课题筛选出一个在肝纤维化过程中过表达并具有人鼠同源性的lnc-Scarna10;lnc-Scarna10在肝纤维化小鼠的原代HCs中的表达明显升高;在TGFβ处理小鼠肝细胞系AML12细胞和正常小鼠原代HCs后,lnc-Scarna10的表达也明显升高。2.与正常人相比,在肝纤维化患者、肝硬化患者的血清和肝组织中lnc-SCARNA10的表达明显升高,且在肝硬化患者血清和肝组织标本中的表达高于肝纤维化患者标本。3.在小鼠肝细胞系AML12细胞和正常小鼠原代HCs中,干扰lnc-Scarna10的表达可以抑制TGFβ引起的HCs凋亡以及纤维化相关基因和炎症相关基因表达的升高。4.在体内,干扰lnc-Scarna10的表达可以抑制胆管结扎(BDL)引起的小鼠肝纤维化的形成。提取各组小鼠原代HCs,结果证实lnc-Scarna10通过促进HCs的凋亡以及纤维化相关基因和炎症相关基因的表达促进肝纤维化发生。5.敲低lnc-Scarna10下调TGFβ信号通路中TGFβ、SMAD2/3、p-SMAD2/3、KLF6等相关组分和肝纤维化相关基因的表达。结论综上所述,我们发现了一个在肝纤维化发生发展中过表达并具有人鼠同源性的lnc-Scarna10。通过体内外实验证明lnc-Scarna10不仅可以促进HCs的凋亡,而且可以促进纤维化相关基因和炎症相关基因的表达,从而促进肝纤维化的发生。机制上,lnc-Scarna10通过调节TGFβ信号通路促进HCs凋亡,从而诱发肝纤维化的发生。进一步的研究表明lnc-SCARNA10在肝纤维化患者和肝硬化患者的血清和肝组织中过表达,且在肝硬化患者血清和肝组织标本中的表达高于肝纤维化患者标本,继而揭示lnc-SCARNA10具有作为肝纤维化早期临床诊断标志物的可能,为肝纤维化的诊断治疗提供实验基础和治疗靶点。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

可见中央静脉缺失、偏位或有 2 个以上，形成假小叶（图1.1a）。天狼猩红染色（Sirius Red staining）：因天狼猩红和其衬染液都是强酸性染料，易与胶原分子中的碱性基团结合且吸附牢靠。故可用于各种组织病变时对胶原纤维异常或纤维增生的研究中，胶原纤维被染成红色。镜下观察可见对照组小鼠肝组织仅可见少量红色纤维结缔组织，而实验组小鼠肝组织中可见大量呈现红色的纤维结缔组织沉积，沉积的纤维结缔组织重新包饶坏死再生的肝细胞形成假小叶。通过免疫组织化学染色（IHC staining）对 Col1α1 和α-SMA 进行检测，DAB显示为黄褐色即为阳性结果。对照组小鼠镜下观察 Col1α1 和α-SMA 呈阴性；实验组小鼠可见肝组织中 Col1α1 和α-SMA 呈现强阳性，黄褐色在肝窦、中央静脉周围以及纤维间隔之间有明显表达（图 1.1a）。提取对照组和实验组小鼠的肝组织总 RNA，进行 qRT-PCR 检测，结果可见实验组小鼠肝组织中的 Col1α1 和α-SMA 的表达量明显高于对照组（图 1.1b）。肝纤维化发生时细胞外基质明显增多，现已知细胞外基质由胶原、非胶原糖蛋白以及蛋白多糖三种成分构成，其中胶原含量最多。羟脯氨酸为胶原内存在的一种非必需氨基酸，因此小鼠肝组织中羟脯氨酸含量的高低可以直接反映出肝纤维化的程度。实验检测，实验组小鼠肝组织中羟脯氨酸的含量明显高于对照组（图 1.1c）。经上述几种方法，我们可以得出结论：经过腹腔注射 CCl4后

天津医科大学硕士学位论文达下调的 lncRNAs 有 447 个（图 1.2a）。根据 lncRNAs 的差异倍数，选取 10 个差异表达的 lncRNAs 并在 CCl4诱导的纤维化肝组织中进行扩大样本的再次验证。在此基础上筛选出显著过表达的ENSMUST00000158992 ， 在 数 据 库 中 被 命 名 为 lnc-Scarna10 （ small Cajalbody-specific RNA 10, U85）做后续研究。同时通过同源序列比对找到在人基因组中同源转录本 lnc-SCARNA10。

23图 1.3 Lnc-SCARNA10 的鉴定（a-b）cDNA 末端快速扩增技术(RACE)确定人（b）以及小鼠（a）lnc-Scarna10的全长序列；（c）通过核浆分离技术提取小鼠正常原代 HCs 和小鼠肝细胞系AML12 细胞核 RNA 和细胞浆 RNA，qRT-PCR 检测 lnc-Scarna10 的细胞定位及表达。1.2.4 Lnc-Scarna10 表达谱的验证为了研究 lnc-Scarna10 在肝纤维化中的作用，我们在构建的 BDL（胆管结扎）诱导的肝纤维化小鼠模型中对 lnc-Scarna10 在肝纤维化不同阶段的表达情况进行了检测。小鼠分为对照开腹组、胆管结扎诱导 3 天、14 天、21 天四组。在每组处理时间终点分别麻醉处死小鼠，然后提取肝组织 RNA，qRT-PCR 结果发现 Acta2 随着肝纤维化程度的加深而表达水平逐渐升高，同时 lnc-Scarna10 也表现出逐渐上升的趋势（图 1.4a）。说明 lnc-Scarna10 在肝纤维化中是高表达的，并在肝纤维化发生过程中表达逐渐升高，与芯片结果一致。
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本文编号：2874212