基于miR-34a调控Wnt通路探讨有氧运动抗OJ小鼠肝损伤研究

发布时间：2020-11-08 22:47

　　 研究目的:本研究采用阻塞性黄疸(OJ)肝损伤KM小鼠为实验研究对象,观察有氧运动对OJ肝损伤小鼠干预作用以及miRNA介导Wnt通路相关因子在肝和血液组织差异表达的比较分析。研究方法:采用本课题组构建的一种新的胆总管悬挂OJ肝损伤小鼠模型,40只雄性KM小鼠随机分为4组:假手术组(SO)、模型组(M)、有氧运动组(TM)、水飞蓟宾组(SFJB)。其中除假手术组、假手术对照组外都以总胆管悬挂至腹壁48小时构建OJ小鼠模型。水飞蓟宾组于胆总管结扎术后约3天进行水飞蓟宾灌胃,每天固定在下午4点至6点,剂量为0.4ml/次,共6周。中等强度有氧运动组小鼠训练坡度为0%,无负重,速度12m/min(75%VO_2max),每天固定训练60min,每周6天,共6周。干预结束后,取材前一晚小鼠禁食过夜,称重,麻醉完全后收集血液,处死动物分离肝组织。采用血生化检测血清中总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和清门冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平;HE染色对比小鼠肝脏组织形态及结构的病理改变;免疫组织化学法检测肝脏组织wnt1、β-catenin、cyclinD1、HGF的表达以及Ki67细胞计数;荧光定量PCR检测血液和肝组织中wnt1、LRP5、β-catenin、cyclinD1、HGF的表达。研究结果:(1)HE染色显示:SO组小鼠肝细胞索呈放射状排列;M组小鼠的肝细胞发生萎缩,肝索断裂,核固缩等,间质可见红细胞堆积;SFJB组、TM运动组肝小叶完整,肝索排列整齐,无形变及坏死现象。(2)M组中TBIL、ALT、AST含量最高,TM组、SFJB组含量最低(P0.01);(3)qRT-PCR结果显示:与M组比较,SFJB组,TM组wnt1、LRP5、β-catenin、cyclinD1、HGF mRNA表达水平显著增加(P0.05,P0.01);miRNA结果显示,与M组比较,TM组、SFJB组的miR-34a水平显著下调,具有统计学差异(P0.05)。(4)免疫组织化学法结果显示:wnt1、β-catenin、cyclinD1、HGF在SO组中低表达,SO组β-catenin、cyclinD1为阴性表达;与M组比较,TM组、SFJB组wnt1、β-catenin、cyclinD1、HGF表达增高(P0.01)。与M组比较,TM组、SFJB组Ki67阳性表达率明显增加,具有统计学意义(P0.01)。结论:中等强度有氧运动对OJ小鼠引发的肝损伤有明显缓解作用,能不同程度促进肝细胞修复,其抗损伤作用与SFJB组作用相近。其作用机制与运动通过miR-34a介导激活Wnt信号通路发挥着关键性的作用有关。Wnt通路中的相关因子wnt1、β-catenin、和HGF在血浆中的表达水平作为一种无创的、简单易行的检测手段,为肝脏疾病的诊断及发生发展过程中标志物的筛选具有良好的应用价值。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575
【部分图文】：

基于 miR-34a 调控 wnt 通路探讨有氧运动抗 OJ 小鼠肝损伤研究4）及 LGR5 结合，通过增强 Wnt 信号传导，进而增加 LRP6 的 Wnt 依赖性[17,18]。R-spondin 配体也通过跨膜 E3 泛素连接酶锌、ZNRF3 以及它的同源，增强 Wnt 信号传导。其中泛素化 Frizzled 和 LRP6 将它们靶向蛋白酶降解蛋白在血浆膜上的募集破坏了破坏复合体，促进了β-catenin 的稳定化和细积。非磷酸化的β-catenin 转运至细胞核，通过与 LCF/LEF 结合形成复合体下游靶基因的转录过程。Wnt 信号通路在细胞之间的信号传导作用，对肝增殖、分化以及再生、修复有着重要的影响[20]。

图 2-1 实验技术路线图2.4.2 模型的构建及实验对象的分组2.4.2.1 动物造模拟采用成年健康雄性昆明种（KM）小鼠，54-56 日龄，体重 23g-25g，适应性喂养一周后，参照胆总管结扎方法[25]并改进，手术前禁食，腹腔注射 1%戊巴比妥钠（500mg/kg 体重）进行麻醉，消毒，仰卧位固定于手术板，小鼠腹部剑突下 4毫米处备皮，用棉签蘸取少许碘伏涂抹在备皮部位消毒，镊子轻轻夹起备皮皮肤，纵向剪开长约 1-1.5cm 的切口，露出肝脏。用玻璃分针拨动肝脏找出胆总管，用4-0 不可吸收手术线将胆总管悬挂于腹壁，关好腹腔后胆管成 90°弯曲，缝合手术伤口。2.4.2.2 实验分组实验动物选用健康雄性 KM 小鼠 40 只，随机分为 4 个组。

嗜睡。手术24h之后，模型组小鼠的尿液颜色逐步变黄。48h之后模型组小鼠皮肤、毛发、耳尖等部位出现局部发黄，待第七天随机抽取10只小鼠进行剖腹检查，发现结扎近端胆总管囊性扩张加重，肝脏肿大呈淤胆性改变。由此，我们推断出造模成功，经过一段时间有氧运动干预之后，TM组小鼠症状轻于M组。3.2 血清学指标检测表 3-1，图 3-1 显示：相比 M 组，SO 组、TM 组、SFJB 组 TBIL、ALT、AST含量均有不同程度的下降（P<0.05，P<0.01），SFJB 组含量最低（P<0.01）其次为 TM 组（P<0.01）。表 3-1 小鼠血清 TBIL、ALT、AST 含量比较 ( ±S)注：与假手术组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05,##P＜0.01组别 n TBIL ALT ASTM 10 29.03±1.97**43.03±1.52**38.01±2.26**TM 10 18.25±0.87**##25.12±2.33**##25.43±1.17**##SFJBSO101016.23±0.87**##8.76±0.38##19.03±1.77**##7.78±0.64##20.41±1.12**##7.46±0.54##
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本文编号：2875470