人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素免疫功能验证

发布时间：2020-11-10 17:59

　　 干扰素（IFN）和核苷类似物是临床上治疗慢性乙型肝炎（CHB）的常用药物,具有抗病毒作用，能抑制乙肝病毒（HBV）DNA的复制。而核苷类似物普遍存在药物抗性、疗效不稳定、长期使用的安全性等问题。因此，干扰素成为治疗乙肝的首选药物，然而常规干扰素制剂的血浆半衰期短，清除快，需大剂量长期使用，停药后易复发，更不能彻底消除HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）。综上所述，开辟一条全新有效的新途径，清除致耐原，打破和逆转机体持续性深度免疫耐受，意义重大。 随着科学技术的不断发展，抗体也从血清抗体发展到基因工程抗体。本实验室成员前期已从噬菌体抗体库中筛选出人源抗HBsAg基因工程抗体，并利用PCR定点突变获得二硫键稳定的dsFv（disufide-stabilized Fv fragments）抗体，将人源抗表面抗原（HBsAg） dsFv抗体的干扰素轻链和重链基因通过自身切割肽F2A连接，置于同一开放读码框（ORF），使抗体的轻链和重链在同一质粒中串联表达，最后连接到pEE14.1高效表达载体上，获得表达抗体靶向干扰素的重组质粒pEE14.1-dsFvα pr+。 本研究的目的在于在对实验室前期构建的新型靶向干扰素药物进行免疫功能验证，并选择最优的载体和药物的组合。具体方法如下：首先，设计动物实验并通过酶切和PCR等方法构建三种对照质粒：只表达人普通α干扰素（IFN-α）基因的质粒pEE14.1-IFN-α和pSCK-IFN-α；表达抗体靶向干扰素复合基因的质粒pSCK-dsFvα pr+。并分别在真核哺乳细胞系293T中验证表达，再用ELISA，western等方法检测表达水平。随后，与实验室保存的另外3种质粒： pEE14.1-dsFvα pr+， pVAX-IL-12-dsFvα pr+和pSCK-IL-12-dsFvα pr+分别免疫6到8周龄的转基因小鼠，间隔7天，每组3只，每只给药30μg。在每次免疫前后均取血，定量PCR检测转基因鼠治疗前后血清中病毒拷贝量，反映药物的治疗效果。最后，为了得到更准确的实验数据，进行了脉冲条件的优化。将编码荧光素酶基因的pGL-3-CMV质粒利用肌肉注射配合电穿孔技术递送至C57小鼠体内，2次免疫结束后，检测小鼠体内的荧光素酶活性，通过荧光素酶活性的变化来比较不同脉冲时间和脉冲电压在递送质粒DNA时所诱导的表达效率。 结果证实，构建的质粒均可成功表达，用于动物实验后显示，人源化抗体靶向干扰素较普通干扰素效果有明显优势，可较大幅度降低病毒拷贝量，并且8个月后反弹很小。而经过加工连入IL-12的抗体靶向干扰素效果更佳，有转阴现象。新的脉冲条件60v，50ms也较实验室前期用的180v，25ms表达效率高，且对注射局部肌肉组织的刺激和损伤较低。 综上所述，人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素针对血循环中过量存在的致耐循环抗原（病毒颗粒和HBsAg亚病毒颗粒），使带有抗体的免疫治疗制剂与血液中的病毒颗粒和亚病毒颗粒靶向结合，有利于其被机体识别和免疫清除，从而大大解除了免疫耐受。有望成为一种新型的治疗慢性肝炎的药物，具有研发潜力。
【学位单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

嗜细胞的激活，直接诱导参与呼吸爆发的酶的合成，从而增强巨嗜细胞的杀伤能力；增强NK细胞识别结构的表达，并上调NK细胞合成细胞毒性因子，促进NK细胞的杀伤。图1.1 干扰素的作用机制3 α-干扰素治疗慢性乙型肝炎现状与进展抗病毒治疗是慢性乙型肝炎（CHB）治疗的核心题，但是单用干扰素治疗慢性乙型肝炎(CHB)各地报道结果不一，疗效在个体间有明显差异，HBV-DNA阴转率约为30%~50%不等[14-16]，效果不十分理想，所以多种联合治疗，或对干扰素的改造等新研究新方法不断涌现。3.1 α-干扰素与其他药物的联合治疗杨志勇，张冬平等人，对干扰素与膦甲酸钠联合应用治疗慢性乙型肝炎的疗效进行了研究，结果表明：61名慢性乙肝患者在治疗3个月后，联合组与干扰素组对慢性乙肝患者血清HBeAg/抗-HBe转换率分别为47.8%和28.9%(P>0.05)；对慢性乙肝患者血清HBV-DNA的阴转率分别为69.5%和34.2%(P<0.01)，说明干扰素和膦甲酸钠联用有协同作用，抗病毒疗效要好于单用干扰素组[17]。郑卫东

图2.1 IFN-α序列的扩增图M：DL 2 000maker；1-2：IFN-α 扩增；3：阴性对照.I-IFN-α 的构建FN-α片段与回收得到的pCI-GPI载体连接转化后，提取行双酶切鉴定，12g/L琼脂糖电泳显示，IFN-α成功连于干扰素分泌到胞外。图2.2 pCI-GPI-IFN-α的酶切鉴定

图2.2 pCI-GPI-IFN-α的酶切鉴定M：DL 5000maker；1-2：XhoI和EcoRI双酶切.FN-α 的双酶切鉴定的连有信号肽的IFN-α片段与载体pEE14.1连接后行双酶切鉴定，12g/L琼脂糖电泳显示，3号和6号成功连入pEE14.1载体中。图2.3 重组质粒pEE14.1- IFN-α的双酶切鉴定5000maker；1-7：SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切pEE14.1
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本文编号：2878197