基质Gla蛋白（Matrix Gla protein,MGP）在溃疡性结肠炎发病机制中的研究

发布时间：2020-11-10 16:45

　　 研究背景:近年来溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)在我国发病率呈逐渐上升趋势。维生素D(VitaminD,VitD)和IBD的关系也日益受到学者的关注。VitD除调节钙、磷代谢外,对人体还具有抗感染、免疫调节等作用。流行病学及国内外临床研究发现UC患者中VitD缺乏发生率高。但VitD预防UC尚处于探索阶段,其在分子水平拮抗UC的机制也尚未完全明了。基质Gla蛋白(MatrixGlaProtein,MGP)是首个报道的血管和软骨钙化抑制剂,已知活性维生素D可以直接调节MGP表达,MGP蛋白作为一种基质成分,在钙磷代谢、肿瘤发生发展中起着重要作用。但MGP蛋白与UC发病的关系尚未可知,也未见报道。研究目的:(1)探究MGP蛋白在UC发病过程中mRNA和蛋白表达改变及作用;(2)探讨MGP蛋白的上游调控通路和下游通路,及其可能的功能。方法:分别采用实时定量PCR和免疫组化法检测MGP mRNA和蛋白在UC患者病变结肠黏膜和健康对照者结肠黏膜组织中的表达。C57BL/6小鼠给予含不同浓度(分别为2%、2.5%、3%)葡聚糖硫酸钠(DSS)以建立急性结肠炎模型(对照组n=5,不同DSS组n分别为5、9、6),造模后第9天处死小鼠后评价结肠大体和病理炎症,免疫组化和westernblot法检测病变结肠黏膜中差异表达的MGP蛋白的水平。生物信息学预测MGP可能受到早期生长反应基因-1(Egr1)及p38-MAPK-JNK通路调节,westernblot法检测小鼠结肠黏膜中Egr1、p38、磷酸化p38(p-p38)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)水平,以及黏膜屏障相关蛋白occludin、E-cadherin和肠三叶因子TFF3水平,分析其与MGP蛋白之间的相关性。双荧光素酶报告基因检测转录因子Egr1对MGP基因启动子区活性的影响。脂多糖LPS刺激DLD-1细胞,建立体外炎性细胞模型,染色质免疫沉淀法(CHIP)检测Egr1与MGP基因启动子区相结合。构建MGP过表达慢病毒载体,感染结肠癌细胞Caco2和DLD1,嘌呤霉素筛选得到MGP稳转细胞系,westernblot检测E-cadherin蛋白表达变化。结果:1.MGPmRNA在UC患者(n=50)肠黏膜中的表达较健康对照组(n=17)明显升高,在重度UC患者中的表达水平高于轻中度UC患者(8.33±0.63 vs 3.87±0.35vs1.95±0.06,P0.01)。2.免疫组化结果显示,MGP蛋白主要位于UC患者结肠黏膜上皮细胞和杯状细胞的胞浆内,正常结肠黏膜内未见明显表达。2.DSS模型组小鼠体重下降明显,病理炎症评分显著高于对照组(P0.01)。随着DSS浓度增加,小鼠结肠炎症加重,MGP的表达水平也呈逐渐升高趋势,均明显高于对照组小鼠。3.模型组小鼠结肠组织中Egr-1、p38、p-p38、JNK、p-JNK蛋白的表达均高于正常对照组小鼠(P0.01),与MGP的表达变化呈正相关性。E-cadherin、occludin、TFF3蛋白的表达低于对照组小鼠(P0.01),与MGP的表达变化呈负相关。4.转录因子Egr-1显著增强MGP启动子区的转录活性。5.脂多糖LPS刺激DLD-1细胞成功建立体外炎性细胞模型,CHIP结果显示Egr1在MGP启动子区的结合明显增高。6.成功构建MGP过表达慢病毒载体,感染Caco2和DLD1细胞后得到MGP稳转细胞株,MGPmRNA水平升高。E-cadherin蛋白表达较对照组细胞下降。结论:MGP蛋白在溃疡性结肠炎中表达升高,受到转录因子Egr-1及p38-MAPK-JNK通路的调控,可能通过影响肠道黏膜屏障参与肠道炎症发病机制。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R574.62
【部分图文】：

动组明显高于对照组、缓解组、轻度活动组和中度活动组，分别为７．?９３倍、５．４８??倍、４．?２７倍和２．１５倍（Ｐ均＜０．０１）。在对照组和缓解组、轻度活动组之间差异无??统计学意义（见图２和表１１）。??ＭＧＰ??＜?＊＊??ｚ?１５－｜????＊＊??ｆ?：??Ｑ．????〇?？？??￥?１０－?：？??Ｉ?Ｔ?ｆ??＜Ｄ?？??Ｉ?５＂?总？??Ｉ?—令▼?▼▼??｜?〇?Ｉ??１?１?１?１—??／Ｖ?＃?／?／??ｉｆ?令??图２?ＵＣ患者和对照者结肠黏膜组织中ＭＧＰ?ｍＲＮＡ的表达情况??注：ｃｏｎｔｒｏｌ：对照组，ｎ＝１７；?ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：缓解组，ｎ?＝?７；?ｍｉｌｄ：轻度活动组ｎ??＝?１３；?ｍｏｄｅｒａｔｅ：中度活动组ｎ＝?１７；?ｓｅｖｅｒｅ：重度活动组ｎ?＝?１３。采用方差分析??（ＡＮ０ＶＡ），各组数据以均数士标准误（又土ＳＥＭ）表示。材／ＸＯ．?０１。??表１１?ＵＣ患者和对照者结肠黏膜组织中ＭＧＰ?ｍＲＮＡ的表达情况??分组?例数?ＭＧＰ?ｍＲＮＡ相与健康对照与缓解组与轻度活??（ｎ）?对表达?组比较?比较?动组比较??对照组?１７?１．０５±０．１２?—?—?—??缓解组?７?Ｌ?５２?±０．０３?Ｐ＝０．４０９??轻度活动组?１３?１．９５±０．０６?Ｐ＝Ｑ．?０６０?Ｐ＝０．４７９??中度活动组?ｎ?３．８７±０．３５?Ｐ＜０．０１?Ｐ＜０．０１?Ｐ＜０．０１??重度活动组?１３?８．?３３±０．?６３?Ｐ＜０．?０１?Ｐ＜０．?０１?Ｐ＜０．?０１??注：采用方差分析（ＡＮＯＶＡ）

免疫组化法检测重度ＵＣ患者（ｎ＝９）和对照组（ｎ＝６）结肠黏膜中ＭＧＰ蛋白??的表达情况。ＭＧＰ蛋白表达于ＵＣ患者结肠黏膜上皮细胞和杯状细胞的胞浆内，在对??照者结肠黏膜中染色较弱或未见明显阳性表达（图３）。按照着色程度及阳性细胞??数量乘积得分进行评分后取平均值（详见实验方法６．免疫组织化学染色），ＵＣ患??者组ＭＧＰ蛋白相对表达量（２．?８９?±０．４２）显著高于健康对照组（０．６７±０．２１），差??异有统计学意义（ｔ＝４．?０３，００１）（图４和表１２）。??圖＿??？?人．’?？?．?＇■?：＇?？?ｔ?＊＊？．?＜?＃?－．ｖ－１?？?＊，?＊??＾?Ｄ??Ｂ．?－?Ｄ＇??图３免疫组化检测ＵＣ患者及对照组结肠黏膜中ＭＧＰ蛋白的表达情况??注：Ａ：对照组结肠黏膜病理Ｈ＆Ｅ染色（１００Ｘ）?；?Ｂ：对照组结肠黏膜ＭＧＰ蛋白免疫??组化染色未见阳性表达（１００Ｘ）?；?Ｃ

１．不同浓度ＤＳＳ模型小鼠模型的建立：??模型组小鼠第３—５天开始出现大便不成形、肉眼血便等结肠炎症状，同时伴有??体重下降、活动减少、毛发色泽变差，体重变化情况如图４所示。随着ＤＳＳ浓度（浓??度分别为２％、２．５％、３％）的增高，上述症状越明显。症状最重多出现于第７?—８天，??表现为排便无粪质仅有鲜血，或反复刺激小鼠排便后仅能排出少量粘液，此时体重??亦降至最低。２．５％ＤＳＳ组小鼠于第８天死亡１只，３％ＤＳＳ组于第７天、第８天各死亡２??只。??２５??
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本文编号：2878139