硫化氢对氧应激下大鼠肝星状细胞MAPK信号通路影响的研究

发布时间：2020-11-12 00:35

　　 目的：肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的增殖与激活作为肝纤维化发生发展的主要环节之一，各种不同的因素激活HSC，并使细胞外基质大量的形成并沉积后，导致肝纤维化的发生。所以降低自我放大效应和活化后机体损伤是治疗肝纤维化的重点。硫化氢（hydrogen sulfide，H_2S）作为一种气体信号分子是近年来发现的，在循环系统、神经系统疾病的发生中具有重要的作用，具有多种生理功能。为了研究H_2S与肝纤维化之间所存在的关系，利用铁超载的方法建立氧应激模型，在体外复制肝纤维化，给予H_2S的供体硫氢化钠（sodiumhydrosulfide， NaHS）和内源性H_2S作用的KATP通道阻滞剂格列苯脲（glibenclamide，GLBN），通过检测硫化氢对氧应激下大鼠肝星状细胞（HSC-T6）MAPK信号通路影响，验证氧应激下硫化氢对HSC细胞具有保护作用的假说。 方法：将大鼠肝星状细胞分为6组：空白组（B组，HSC-T6）；氧化应激模型组(C组，B组+500μmol/L Fe-NTA)； N1组(C组+100μmol/L NaHS)；N2组（C组+200μmol/L NaSH）；N3组（C组+400μmol/L NaHS）；格列苯脲组（GLBN组，C组＋200umol/L）。用铁超载的方法复制HSC氧化应激模型，RT-PCR和WesternBlot检测p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK在24h和48h时的mRNA和蛋白质水平变化。 结果：在氧应激模型下，给予FeNTA24和48h时以后，模型组p38、ERK和JNKmRNA水平与空白组比较均升高明显(P0.05)。给予100、200、400μmol/L NaHS处理后三组的p38mRNA水平和C组比较，表达逐渐降低，差异显著(P0.05)，三个不同浓度的组间相比较差异显著(P0.05)。GLBN组的p38mRNA表达水平有所上升，差异显著(P0.05)。然而，ERK和JNK mRNA水平在给予不同浓度NaHS处理的N1组、N2组、N3组的ERK和JNK mRNA水平和模型组比较时，无明显变化，差异无统计学意义(P0.05)，三组不同浓度间的组间差异均无统计学意义(P0.05)。加入格列苯脲后，ERK和JNK mRNA表达水平无明显变化。 在蛋白质水平，p-p38、p-ERK、p-JNK模型组与空白组比较均升高明显(P0.05)。给予100、200、400μmol/L NaHS处理后三组的p-p38蛋白质表达水平和C组比较，逐渐降低，差异有统计学意义(P0.05)，经上述不同浓度NaHS处理后的三个组间相比较，差异均有统计学意义(P0.05)。GLBN组，p38蛋白质表达水平有所上升，但低于C组。然而，模型组（p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK）蛋白质水平与空白组相比较无明显变化(P0.05)。给予100、200、400μmol/L NaHS处理后三组的p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白质水平和模型组比较，差异无统计学意义(P0.05)，并且经上述不同浓度NaHS处理后的三个组间相比较，差异均无统计学意义(P0.05)。加入格列苯脲后，在蛋白质表达水平，ERK、JNK、p-ERK、p-JNK无明显变化。 结论：硫化氢对氧应激下大鼠肝星状细胞（HSC-T6）的MAPK信号通路的影响是通过抑制p38实现的。
【学位单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

第二章 实验结果2.1 RT-PCR 法测定 p38、ERK、JNK 基因表达水平2.1.1 RT-PCR 法检测细胞中的 p38 表达结果：在氧应激模型下，24h 和 48h 时后提取细胞 RNA 并逆转为 cDNA，（p38RT-PCR 的退火温度为 56℃。）RT-PCR 结果显示：C 组 p38 mRNA 水平与B 组比较均升高，差异显著 (P<0.05)。给予不同浓度 NaHS 处理后三组的 p38mRNA 水平和 C 组比较，表达逐渐降低，差异显著(P<0.05)，三个剂量组间差异显著 (P<0.05)。GLBN 组的 p38mRNA 表达水平有所上升，差异显著(P<0.05)。（图 1 和表 1）

200μmol/L-1NaHS 组(N2 组)200 1.533±0.071+1.623±0.117+400μmol/L-1NaHS 组(N3 组)400 1.493±0.141+1.561±0.104+GLBN 组 200 1.537±0.143+1.642±0.131+注: +表示与空白组比较 P<0.05；#表示与模型组比较 P<0.05；*表示三个剂量组间和不同时段间比较 P<0.052.1.3 RT-PCR 法检测细胞中的 JNK 表达结果：在氧应激模型下，24h 和 48h 时后提取细胞 RNA 并逆转为 cDNA，（JNKRT-PCR 的退火温度为 56℃。）RT-PCR 结果显示：C 组 JNK mRNA 水平与 B 组比较均升高，差异显著(P<0.05)。给予不同浓度 NaHS 处理后的三组的 JNK mRNA 水平和 C 组比较，表达逐渐降低，差异显著(P<0.05)，三个剂量组间差异显著 (P<0.05)。GLBN 组的 JNKmRNA 表达水平有所上升，差异显著(P<0.05)。（图 3 和表 3）

400μmol/L-1NaHS 组(N3 组)400 1.454±0.154+1.543±0.157+GLBN 组 200 1.354±0.174+1.372±0.147+注: +表示与空白组比较 P<0.05；#表示与模型组比较 P<0.05；*表示三个剂量组间和不同时段间比较 P<0.052.2 Western Blot 法测定 p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平2.2.1Western Blot 法检测细胞中的 p38、p-p38 蛋白质表达结果：在氧应激模型下，24h 和 48h 时后提取细胞蛋白质进行 Western Blot 实验，结果显示：C 组p- p38 蛋白质表达水平与 B 组比较均升高，差异显著 (P<0.05)。给予不同浓度 NaHS 处理后的三组的 p- p38 蛋白质表达水平和 C 组比较，表达逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)，加入不同浓度 NaHS 处理后的三个组相比较差异均有统计学意义(P<0.05)。GLBN 组，p38蛋白质表达水平有所上升，但低于 C 组（图 4 和表 4）
【参考文献】

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本文编号：2879982