IL-10基因修饰的大鼠肝细胞对肝星状细胞的影响及其可能机制

发布时间：2020-11-15 04:21

　　 目的研究大鼠肝细胞及白细胞介素-10(IL-10)对原代肝星状细胞(HSC)增殖、活化及凋亡的影响,并探讨其可能机制。 方法用RT-巢式PCR方法获取大鼠IL-10基因的全长编码序列,采用分子克隆技术构建其真核表达载体pcDNA3.0-rIL-10,并进行双酶切法及测序鉴定。通过有或无去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体将重组质粒转染大鼠肝细胞系BRL,采用RT-PCR及ELISA方法观察IL-10 mRNA和分泌型IL-10蛋白的表达情况,用MTT法及流式细胞分析法检测转染空质粒和重组质粒的BRL细胞的增殖、凋亡情况。分别将正常的、转染pcDNA3.0空质粒及转染pcDNA3.0-rIL-10质粒的BRL细胞与原代HSC共培养,通过相差显微镜下观察、MTT、原位末端标记检测(TUNEL)、western blot等方法观察各组HSC的表型变化、增殖、凋亡、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及I型前胶原的表达。用抗体芯片技术检测各组BRL细胞的培养上清液中细胞因子的表达差异。 结果成功构建重组质粒pcDNA3.0-rIL-10,并转染BRL细胞,获得高水平的IL-10表达,而后者抑制了BRL细胞的凋亡。发现受体介导的脂质体转染效率明显高于非受体介导的脂质体。BRL细胞显著促进HSC的增殖、凋亡以及α-SMA和I型前胶原的表达,使HSC的脂滴消失加速,收缩性增强。IL-10则抑制HSC的增殖、以及α-SMA和I型前胶原的表达,进一步促进HSC的凋亡。抗体芯片显示,BRL细胞的培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)等三种细胞因子显著上调,转染pcDNA3.0-rIL-10质粒的BRL细胞较之转染空质粒者IL-10显著上调,VEGF下调。 结论受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性,可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体。肝细胞促进HSC的增殖与活化,其机制可能与其表达VEGF、MCP-1、TIMP-1等细胞因子有关。IL-10可抑制HSC的增殖与活化,促进HSC凋亡,其机制除直接作用于HSC,还可能通过抑制肝细胞表达VEGF而间接作用。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R575.2
【部分图文】：

见分子量分别为 5000bp 左右和 550bp 左右两条目的片段，而空质粒只有 5000bp左右的一条带（图 2）。图2 重组质粒pcDNA3.0-rIL-10经Bam HI和Hind III双酶切鉴定1：1kb DNA Marker 2：pcDNA3.0-rIL-10双酶切 3：pcDNA3.0空质粒对照

加入 10μl 的 20μg/ mL 碘化丙锭贮存液（终浓度用流式细胞仪进行分析。采用卡方检验分析各组间凋亡率的差异。结 果et-gal脂质体与transfastTM脂质体对BRL细胞转染T-PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶上电泳后，A、B 两组右见到两条清淅目的条带（β-actin 和 rIL-10）。NA 表达水平较低（远低于β-actin），在转染后 2第 8 天表达消失。而 PEIjet-gal 脂质体组 IL-10fastTM脂质体组（远高于β-actin），在转染结束即6 d 后才开始下降，仍有较高表达，如图 1。

组质粒转染后分泌型 IL-10 的表达染 pcDNA3.0 空质粒者几乎测不到 IL-10 的表达；转染重组质粒者度的分泌型 IL-10 的表达，在转染结束后 2 天达到高峰（12.78n即迅速下降，第 8 天后保持长时间的低水平表达，如表 1，其表达表 1 转染质粒后 BRL 细胞分泌型 IL-10 的表达（pg/ml）天数1 2 4 8 12 16 20 粒组 4754.5 12778.8 3344.2 218.6 226.9 168.7 106.8 粒组 11.97 16.09 9.49 11.97 21.1 11.14 17.74
【参考文献】

相关期刊论文 前5条

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本文编号：2884331