苯扎贝特对原发性胆汁性肝硬化患者Th17分化影响的研究

发布时间：2020-11-17 21:50

　　 目的： 原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是种以肝内小胆管进行性、非化脓性炎症为特征的自身免疫性疾病。如何有效治疗PBC,改善患者的预后及生存质量是目前研究的热点。国外临床实践发现PPAR泛激动剂苯扎贝特(Bezafibrate, BF)对PBC患者有一定疗效,但其作用机制不明。我们前期研究发现PBC患者外周血中Th17细胞的表达水平明显高于健康对照组,提示苯扎贝特的疗效有可能通过干预Th17细胞分化而发挥作用。本研究拟从PBC患者临床样本分析来探讨苯扎贝特靶向Thl7细胞治疗PBC,为进一步揭示PBC发病机理,寻找更具免疫调节功能的干预措施提供实验室依据。 方法： 1.苯扎贝特影响Thl7细胞分化最佳浓度的筛选 采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞(PBMC);免疫磁珠分选技术(MACS)分选CD4+T细胞。CD4+T细胞以1×109/L的密度分4组进行培养,加入不同浓度的苯扎贝特诱导刺激： (1) medium组; (2)10μM BF组； (3)50μM BF组; (4)100μM BF组; 流式细胞术检测苯扎贝特抑制Thl7细胞分化的最佳浓度。 2.苯扎贝特体外干预PBC患者Th17细胞分化 (1)Ficoll-Hypaque密度梯度离心法及MACS从PBC患者和正常人外周血中分选CD4+T细胞,不同浓度的苯扎贝特诱导刺激培养： ①medium组 ②50μM BF组 流式细胞术检测苯扎贝特对Th17细胞分化的影响。 (2) RT-PCR检测PBC患者和正常人外周血中CD4+T细胞培养9天后IL-17和INF-γ mRNA的表达。 (3)ELISA检测PBC患者和正正常人外周血中CD4+T细胞培养9天后上清液中IL-17和INF-γ表达水平。 结果： 1.苯扎贝特在一定范围内呈剂量依赖性抑制正常人外周血Thl7细胞分化,其中50μM处理后,IL17表达阳性细胞率最低(0.1%～0.5%),平均0.3%左右,是抑制Th17细胞分化的最佳浓度。 2.苯扎贝特处理PBC患者和正正常人外周血CD4+T细胞中IL-17+IFN-γ-,IL-17+IFN-Y+表达水平较未处理组均显著降低(P＜0.05)；只表达IFN-γ的CD4+T细胞较未处理组均无明显差异(P＞0.05)。 3.苯扎贝特处理PBC患者和正常人外周血CD4+T细胞后,IL-17mRNA表达水平均明显低于未处理组(P＜0.05)；而IFN-γ mRNA表达水平较未处理组均无明显差异(P＞0.05)。 4.苯扎贝特处理PBC患者和正正常人外周血CD4+T细胞培养上清液中IL-17水平较未处理组均显著降低(P＜0.05),而IFN-γ水平较未处理组均无明显差异(P＞0.05)。 结论： 初步筛选出50洲苯扎贝特是抑制Thl7细胞分化的最佳浓度；在Th17细胞极化条件下,苯扎贝特明显抑制PBC患者外周血中CD4+T细胞中IL-17表达,而不影响IFN-γ表达。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R575.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
引言
第一部分 苯扎贝特影响Th17细胞分化条件的建立
    1.1 主要材料和试剂
    1.2 主要仪器
    1.3 免疫抑制药
    1.4 研究对象
    1.5 方法
        1.5.1 外周血单个核细胞（PBMC）的获取
+T细胞分选'>        1.5.2 CD4⁺T细胞分选
        1.5.3 细胞培养
        1.5.4 苯扎贝特对细胞增殖的影响
        1.5.5 流式细胞术检测
    1.6 结果
        1.6.1 BF对细胞增殖的影响
        1.6.2 BF在体外诱导Th17细胞分化的最佳刺激浓度
    1.7 讨论
第二部分 苯扎贝特体外干预PBC患者Th17细胞的分化
    2.1 主要试剂与试剂配制
    2.2 主要仪器
    2.3 实验标本
        2.3.1 PBC患者组
        2.3.2 健康对照组
    2.4 方法
        2.4.1 外周血单个核细胞（PBMC）的获取
        2.4.2 CD4+T细胞分选
        2.4.3 细胞培养
        2.4.4 荧光定量PCR技术检测IL-17基因的表达
        2.4.5 ELISA检测上清液IL-17含量
        2.4.6 ELISA检测上清液IFN-Y含量
        2.4.7 统计学分析
    2.5 结果
+T细胞培养情况'>        2.5.1. 纯化的CD4⁺T细胞培养情况
+T细胞中Th17分化'>        2.5.2 在Th17细胞极化的条件下,BF抑制PBC患者和正常人外周血CD4⁺T细胞中Th17分化
+T细胞中IL-17mRNA的表达'>        2.5.3 BF抑制PBC患者和正常人外周血CD4⁺T细胞中IL-17mRNA的表达
    2.6 讨论
结语
参考文献
附录
    附录1：缩略语
    附录2：主要生化试剂及配制
    附录3：综述
在校期间发表论文情况
致谢

【参考文献】

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1 张文忠;姚萍;;原发性胆汁性肝硬化发病的分子机制研究进展[J];重庆医学;2009年21期

2 黎钟燕;;熊去氧胆酸治疗原发性胆汁性肝硬化临床观察[J];中国现代医生;2010年33期

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4 陆伦根;田丽艳;徐铭益;冯赟;徐正婕;孟祥军;;欧洲肝病学会临床实践指南:胆汁淤积性肝病的治疗(2)[J];肝脏;2009年06期

本文编号：2887957